Abreu da silva, Alexandra (2004) Cloning and expression of bovine prochymosins A, B and B S79N in Escherichia coli and Pichia pastoris. Study of mutation S79N. PhD thesis Biochimie, INAPG 2004INAP0001.
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Abstract
Chymosin, an enzyme used in cheese manufactures as a milk-clotting agent, is traditionaly prepared from the fourth stomach of unweaved calves. This crude preparation called rennet has been substituted by microbial and plant coagulants for years since chymosin production was unable to satisfy the world demand especially due to the increase of cheese production. However, chymosin still remains the better milk-clotting enzyme. Thus, genetic engineering techniques are used to produce recombinant bovine chymosin. Using these techniques, we propose to establish the conditions for production of recombinant bovine industry of Brazil and countries of the Economic Market of "Cone Sul" (MercoSul).
We cloned the cDNA encoding preprochymosin A and preprochymosin B using standard techniques of molecular biology. We observed mutations in the region of propeptide of prochymosin A and in the mature part of prochymosin B. This last mutation, S79N, is localized in the region of the flap (residues 72 to 86), a flexible loop located at the entrance of the active site cleft. The conformation of the flap is characteristic of chymosin and is presumably responsible for the chymosin specificity. We modeled this mutation that seems to involve changes in the hydrogen network of the flap. The cDNA sequences were introduced into different expression vectors and cloned into Escherichia coli and Pichia pastoris. Protein expression was analyzed with specific antibodies and with activity assays. The different proteins are all actives and were purified. We studied kinetic properties using different substrates. Chymosin B and chymosin B S79N show an optimum pH that differentiates them from chymosin A. The mutant B S79N show improved kinetics properties with the synthetic hexapeptide. The mutation S79N leads however to a little increase of efficacy constant concerning hydrolysis of -casein and milk. These results can be explained by changes in the hydrogen network of the flap and by the fact that the number of interactions between substrate and enzyme is a function of the molecular mass and the kind of the substrate.chymosin, allowing technological innovation and contributing to the development of food
| Item Type: | PhD Thesis (PhD) |
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| Additional Information: | LISTE DES TABLEAUX Tableau I.1: Clans et familles des peptidases à sérine - 25 Tableau I.2: Clans et familles des peptidases à cystéine - 29 Tableau I.3: Clans et familles des peptidases à acide aspartique - 32 Tableau I.4: Clans et familles des peptidases à métal - 34 Tableau I.5: Clan et familles des peptidases à thréonine - 35 Tableau I.6: Clan et familles des peptidases à type catalytique inconnu - 36 Tableau I.7: La chymosine bovine recombinante est aujourd´hui disponible sur le marché sous trois différentes formules commerciales - 44 Tableau II.1: Amorces utilisées dans cette étude - 58 Tableau III.1: Variants de la chymosine bovine - 97 Tableau III.2: Transformation et criblage des clones de P. pastoris - 127 Tableau III.3: Bilan des étapes de purification de la chymosine A à partir de la culture du clone 4S9 - 153 Tableau III.4: Bilan des étapes de purification de la chymosine B S79N à partir de la culture du clone 2S8 - 154 Tableau III.5: Bilan des étapes de purification de la chymosine B à partir de la culture du clone 37 - 155 Tableau III.6: Séquences des tampons de différentes protéases à acide aspartique - 157 Tableau III.7: Paramètres cinétiques des réactions d´hydrolyse de l´hexapeptide Leu-Ser-Phe(NO2)-Nle-Ala-Leu-OMe par différentes chymosines - 162 Tableau III.8: Paramètres cinétiques des réactions d´hydrolyse de la caséine par différentes chymosines - 166 Tableau III.9: Activités spécifiques des différentes chymosines sur le lait - 169 LISTE DES FIGURES Figure I.1: Représentation de l´estomac des ruminants - 20 Figure I.2: Schéma représentant la nomenclature des peptidases selon BARRETT (1986) - 22 Figure I.3: Représentation schématique du mécanisme catalytique des protéases à sérine - 27 Figure I.4: Représentation schématique du mécanisme catalytique des protéases à acide aspartique - 30 Figure I.5: Représentation du chardon (Cynara cardunculus) - 39 Figure I.6: Représentation schématique de l´hydrolyse de la caséine par la chymosine bovine - 40 Figure I.7: Schéma de la structure de la préprochymosine - 41 Figure I.8.: Structure tridimensionnelle de la chymosine bovine - 43 Figure II.1: Vecteurs de séquence, (A) pBluescript SK et (B) pZERO-2 - 50 Figure II.2: Vecteur de séquence, pUC72 - 51 Figure II.3: Vecteurs d'expression chez E. coli: (A) pGEX-4T-3 et (B) pTIamy - 53 Figure II.4: Vecteurs d'expression chez P. pastoris, (A) pHIL-S1 et (B) pPIC9 - 54 Figure II.5: Insertion du gène d´intérêt dans le génome de P. pastoris - 56 Figure II.6: Insertion du gène d´intérêt dans le génome de P. pastoris - 57 Figure II.7: Changement du coefficient molaire d´absorption à 310 nm des produits d´hydrolyse du peptide synthétique Leu-Ser-Phe(NO2)-Nle-Ala-Leu-OMe par la chymosine en fonction du pH (SALESSE et GARNIER, 1976) - 73 Figure II.8: Principe du kit "ECL direct nucleic acid labelling and detection system" qui est basé sur le marquage de la sonde d´ADN avec l´enzyme péroxydase - 84 Figure III.1: Analyse des produits d´amplification d´ADNc - 92 Figure III.2: Vérification de l´insertion des produits d´amplification - 93 Figure III.3: Détails du séquençage du clone 40 (chymosine A) et du clone 23 (chymosine B S139N) - 95 Figure III.4: Séquence de la préprochymosine A selon Moir et al. (1982) - 96 Figure III.5: Alignement des séquences de propeptides de différentes protéases à acide aspartique - 99 Figure III.6: Alignement des séquences en acides aminés de différentes protéases à acide aspartique - 101 Figure III.7: Structure tridimensionnelle de la chymosine bovine (4CMS) - 102 Figure III.8: Analyse des plasmides pGEX-4T-3 contenant les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B S79N - 104 Figure III.9: Analyses par électrophorèse SDS-PAGE 10% (A) et par Western-blot utilisant les anticorps monoclonaux anti-GST (B), de l´expression de la protéine de fusion préprochymosine bovine B S79N et GST par E. coli à l´aide du plasmide pGEX-4T-3 et de la solubilisation des corps d´inclusion par différentes concentrations d´urée - 105 Figure III.10: Analyses par électrophorèse SDS-PAGE 10% de l´expression de la protéine de fusion: préprochymosine bovine A et GST par E. coli à l´aide du plasmide pGEX-4T-3 et de la purification partielle de la protéine de fusion - 106 Figure III.11: Analyse des plasmides pTIamy contenant les séquences codant la met-prochymosine A et la met-prochymosine B S79N - 109 Figure III.12: Analyses par Western-blot utilisant les anticorps polyclonaux anti-chymosine de l´expression de la met-prochymosine A, de la met-prochymosine B S79N et de la met-prochymosine B par E. coli à l´aide du plasmide pTIamy - 112 Figure III.13: Construction du plasmide portant la séquence codant la met-prochymosine B à partir des plasmides portant la séquence codant la met-prochymosine A et du plasmide portant la séquence codant la met-prochymosine B S79N - 114 Figure III.14: Analyse des plasmides pHIL-S1 et pPIC9 contenant les séquences codant la met-prochymosine A et la met-prochymosine B S79N - 118 Figure III.15: Analyse du plasmide pPIC9 contenant la séquence codant la met-prochymosine B - 119 Figure III.16: Analyse par SDS-PAGE 10% de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine B par différents clones de P. pastoris et tests d´activité de coagulation du lait des surnageants de culture - 122 Figure III.17: Analyse par SDS-PAGE 10% de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine B S79N par différents clones de P. pastoris et tests d´activité de coagulation du lait des surnageants de culture - 124 Figure III.18: Analyses par SDS-PAGE 12,5% (A) et par Western-blot (B) de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine B par différents clones de P. pastoris - 125 Figure III.19: Analyses par SDS-PAGE 12,5% (A) et par Western-blot (B) de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine B S79N par différents clones de P. pastoris - 126 Figure III.20: Analyse de l´ADN génomique total de différentes souches de P. pastoris - 130 Figure III.21: Analyse par PCR des clones de P. pastoris - 131 Figure III.22: Analyse par PCR des clones de P. pastoris - 132 Figure III.23: Digestion de l'ADN génomique total de différentes souches de P. pastoris - 134 Figure III.24: (A) Analyse par Southern-blot d'ADN génomique total digéré avec 10U de l'endonucléase de restriction BglII de souches différentes de P. pastoris - 135 Figure III.25: (A) Analyse par Southern-blot d'ADN génomique total digéré avec 10U d'endonucléase de restriction BglII de souches différentes de P. pastoris - 136 Figure III.26: (A) Analyse par Southern-blot d'ADN génomique total digéré avec 10U de l'endonucléase de restriction BglII de souches différentes de P. pastoris - 138 Figure III.27: Culture du clone 37 de P. pastoris dans différents types d´erlenmeyers - 139 Figure III.28: Analyses par SDS-PAGE 12,5% (A) et par Western-blot (B) de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine B par différents clones de P. pastoris dont la culture a été réalisée dans des erlenmeyers à baffles - 141 Figure III.29: Biomasse des différents clones de P. pastoris - 143 Figure III.30: Analyses par SDS-PAGE 12,5% (A) et par Western-blot (B) de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine par le clone 37 (prochymosine B) de P. pastoris - 144 Figure III.31: Analyse par SDS-PAGE 12,5% de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine par le clone 2S8 (prochymosine B S79N) de P. pastoris - 145 Figure III.32: Analyse par SDS-PAGE 12,5% de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine bovine par le clone 4S9 (prochymosine A) de P. pastoris - 146 Figure III.33: Analyses par SDS-PAGE 10% (A) et par Western-blot (B) de l'expression et de la sécrétion de la prochymosine B par différents clones de P. pastoris - 147 Figure III.34: Purification de la chymosine A recombinante - 150 Figure III.35: Purification de la chymosine B S79N recombinante - 151 Figure III.36: Purification de la chymosine B recombinante - 152 Figure III.37: Cinétiques d´hydrolyse de l´hexapeptide Leu-Ser-Phe(NO2)-Nle-Ala-Leu-Ome - 162 Figure III.38: Effet du pH sur les vitesses initiales d´hydrolyse du peptide synthétique Leu-Ser-Phe(NO2)-Nle-Ala-Leu par les différentes chymosines - 164 Figure III.39: Cinétiques d´hydrolyse de la caséine - 166 Figure III.40: Durées des phases de latence observées lors de l´hydrolyse de la k-caséine par les différentes chymosines en fonction de la concentration en substrat - 167 Figure III.41: Courbes de turbidimétrie des différentes chymosines - 169 Figure III.42: Etude de la mutation S79N utilisant le programme Swiss-Pdb Viewer chez la chymosine "libre" (4CMS) - 170 Figure III.43: Etude de la mutation S79N utilisant le programme Swiss-Pdb Viewer chez le complexe chymosine/inhibiteur (1CZI) - 171 Figure III.44: Thermostabilité des différentes chymosines à 40oC (A) et à 50oC (B) - 174 LISTE DES ABREVIATIONS A : Absorbance ADN : Acide désoxyribonucléique AMP : Adénosine monophosphate ARNm : Acide ribonucléique messager dNTP : Désoxyribonucléotide triphosphate (N=A, G, C ou T) DTT : Dithiothréitol EDTA : Ethylène-diamine-tétra-acétate IPTG : Isopropyl -D-galactoside kb : kilobase kDa : kilodalton pb : paire de base PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction) PEG : Polyethylène glycol PMSF : Phénylméthylsulfonyl fluorure Rnase A : Ribonucléase A RX : Rayons X SDS : Sodium dodécyl sulfate UV : Rayons ultra-violet X-Gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galactoside |
| Thesis Supervisor: | Chardot, Thierry |
| Date: | March 2004 |
| Board of examiners: | Meunier, J.-c. and Macedo, I. and Bouhallab, S. and Henriques, J.a.p. and Chardot, T. |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biochimie |
| Collection (Fonds): | INAPG |
| Institution: | INAPG |
| Subjects: | 8. Earth Sciences and Environmental Engineering 7. Life Sciences and Engineering 7. Life Sciences and Engineering |
| Uncontrolled Keywords: | recombinant bovine chymosin--Escherichia coli--Pichia pastoris--aspartic proteinases--flap, Hexapeptide--casein, chymosine bovine recombinante--Escherichia coli--Pichia pastoris--protéases à acide aspartique--tampon--hexapeptide--caséine . |
Table of content
Page de titre - 1
Remerciements - 3
Résumé - 4
Abstract - 5
Table des matières - 6
Liste des tableaux - 12
Liste des figures - 13
Liste des abréviations - 17
I.Introduction - 18
I.1. Protéases - 21
I.1.1. Nomenclature et classification - 21
I.1.2. Peptidases à sérine - 24
I.1.3. Peptidases à cystéine - 26
I.1.4. Peptidases à acide aspartique - 28
I.1.5. Peptidases à métal - 31
I.1.6. Peptidases à thréonine - 33
I.1.7. Peptidases non classées - 35
I.2. Coagulants du lait - 37
I.2.1. Coagulants d´origine microbienne - 37
I.2.2. Coagulants de plantes - 38
I.2.3. Coagulants d´origine animale - 38
II. Materiels et méthodes - 47
II.1. Souches bactériennes et levures - 48
II.2. Plasmides - 49
II.2.1. Plasmides de séquence - 49
II.2.2. Plasmides d'expression - 52
II.2.2.1. Chez les bactéries - 52
II.2.2.2. Chez les levures - 52
II.3. Amorces - 55
II.4. Méthodes de base de Biologie Moléculaire - 59
II.4.1. Electrophorèse en gel d'agarose - 59
II.4.2. Dosage de l'ARN et l'ADN - 59
II.4.3. Préparation d'ADN plasmidique - 60
II.4.3.1. Mini-préparations plasmidiques («ébullition») - 60
II.4.3.2. Lyse alcaline - 60
II.4.4. Restrictions enzymatiques - 61
II.4.5. Purification de fragments d'ADN - 61
II.4.6. Clonage - 62
II.4.6.1. Ligature - 62
II.4.6.2. Transformation - 63
II.4.6.2.1. Transformation CaCl2 - 63
II.4.6.2.2. Transformation par éléctroporation - 63
II.5. Clonage de la séquence codant la préprochymosine - 64
II.5.1. Collecte du tissus animal - 64
II.5.2. Extraction de l'ARN total de tissus animal - 64
II.5.3. RT-PCR - 65
II.5.4. Clonage du produit de PCR - 66
II.6. Criblage des bactéries transformées - 66
II.7. Séquençage - 67
II.8. Expression chez Escherichia coli - 68
II.8.1. Induction de l'expression - 68
II.8.1.1. A l´aide du plasmide pGEX 4T-3 - 68
II.8.1.2. A l´aide du plasmide pTIamy - 68
II.8.2. Purification et solubilisation des corps d'inclusion - 69
II.9.Activation et test d'activité - 70
II.9.1. Activation de la prochymosine - 70
II.9.2. Test d'activité sur le lait - 70
II.9.2.1. Test de coagulation du lait - 70
II.9.2.2. Test de turbidimétrie - 70
II.9.3. Test d'activité sur la caséine - 71
II.9.4. Test d'activité sur substrat synthétique - 71
II.9.4.1. Préparation du substrat - 71
II.9.4.2. Activité sur substrat synthétique en fonction du pH - 72
II.9.5. Analyses des données - 74
II.9.6. Thermostabilité - 74
II.10. Analyses par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et immuno-empreintes (Western-blot) - 74
II.11. Anticorps polyclonaux anti-chymosine - 75
II.11.1. Obtention des anticorps - 75
II.11.2. Adsorption des anticorps polyclonaux avec un lysat d´Escherichia coli - 76
II.11.2.1. Préparation du lysat bactérien et saturation des membranes de nitrocellulose - 76
II.11.2.2. Epuisement des anticorps non spécifiques - 76
II.12. Détermination de la concentration protéique - 77
II.12.1. Spectrophotométrie - 77
II.12.2. Méthode de Bradford - 77
II.12.3. Méthode BCA - 78
II.13. Pichia pastoris - 78
II.13.1. Transformation de Pichia pastoris - 78
II.13.1.1. Préparation de cellules compétentes pour l'éléctroporation - 78
II.13.1.2. Préparation de l'ADN à être transformé - 79
II.13.1.3. Transformation - 80
II.13.2. Sélection des transformants - 80
II.13.2.1. Mut+/Muts - 80
II.13.2.2. Expression de la met-prochymosine - 81
II.13.3. Intégration de la séquence codant la met-prochymosine dans le génome de Pichia pastoris - 82
II.13.3.1. Extraction de l'ADN génomique de Pichia pastoris - 82
II.13.3.2. Réaction de PCR - 83
II.13.3.3. Southern blot - 83
II.13.3.3.1. Digestion de l'ADN génomique - 85
II.13.3.3.2. Transfert de l'ADN du gel d'agarose sur membrane de nylon - 85
II.13.3.3.3. Préparation de la sonde d'ADN - 85
II.13.3.3.4. Hybridation des membranes en nylon - 86
II.13.3.3.5. Détection du signal - 87
II.13.4. Production de la met-prochymosine chez Pichia pastoris - 87
II.13.5. Purification de la met-prochymosine - 87
III. Résultats et discussion - 89
III.1. Clonage de la séquence codant la préprochymosine bovine chez Escherichia coli - 90
III.1.1. Extraction de l'ARN total du tissus animal et RT-PCR - 90
III.1.2. Clonage et séquençage des produits d´amplification - 91
III.1.3. Analyse des mutations - 98
III.2. Expression de la préprochymosine bovine chez Escherichia coli - 103
III.2.1. A l´aide du plasmide pGEX 4T-3 - 103
III.2.1.1. Clonage des séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B S79N dans le pGEX-4T-3 - 103
III.2.1.2. Expression des séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B S79N dans le pGEX-4T-3 - 103
III.2.1.3. Purification partielle et tests d´activation/activité de la préprochymosine A et de la préprochymosine B S79N - 107
III.2.2. A l´aide du plasmide pTIamy - 108
III.2.2.1. Clonage des séquences codant la met-prochymosine A et la met-prochymosine B S79N dans le pTIamy - 108
III.2.2.2. Expression des séquences codant la met-prochymosine A et la met-prochymosine B S79N dans le pTIamy - 110
III.2.2.3. Purification partielle et tests d´activation/activité de la met-prochymosine A et de la met-prochymosine B S79N - 110
III.2.3. Construction de la séquence codant la met-prochymosine B - 113
III.3. Clonage et expression des séquences codant la met-prochymosine bovine chez Pichia pastoris - 115
III.3.1. Pichia pastoris - 115
III.3.2. Clonage des séquences codant la met-prochymosine chez Pichia pastoris - 116
III.3.3. Transformation et criblage des transformants - 117
III.3.4. Intégration des séquences codant la met-prochymosine bovine dans le génome de Pichia pastoris - 128
III.3.4.1. Extraction de l'ADN génomique de Pichia pastoris - 129
III.3.4.2. PCR - 129
III.3.4.3. Southern-blot - 133
III.3.5. Expression de la met-prochymosine chez Pichia pastoris - 137
III.4. Purification de la met-prochymosine - 142
III.5. Cinétiques de la chymosine A, chymosine B et chymosine B S79N - 156
III.5.1. Importance du tampon ("flap") chez la chymosine - 156
III.5.2. Cinétiques des chymosines recombinantes - 160
III.5.2.1. Cinétiques d´hydrolyse du peptide Leu-Ser-Phe(NO2)-Nle-Ala-Leu - 161
III.5.2.1.1. Paramètres cinétiques des réactions d´hydrolyse - 161
III.5.2.1.2. Effet du pH sur la réaction d´hydrolyse de l´hexapeptide - 163
III.5.3.2. Cinétiques d´hydrolyse de la caséine - 165
III.5.3.3. Cinétiques d´hydrolyse du lait - 168
III.5.3. Modélisation de la mutation S79N - 168
III.5.4. Discussion - 172
III.6. Thermostabilité - 173
IV. Conclusion et perspectives - 176
V. Références bibliographiques - 180
| ID Code: | 795 |
|---|---|
| Deposited By: | Nadine Pontal |
| Deposited On: | 26 July 2004 |
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