Massias, Bastien (2008) Development of Molecular Tools for the Identification of Complex Bacterial Flora – Application to the Study of Galliform Gut Flora. PhD thesis Microbiologie, Laboratoire de Microbiologie et Biochimie Appliquée, INAPG 2008AGPT0101 p.367.

Full text available as: - THESE_MASSIAS_Bastien_2008-AGPT-0101.pdf ( 6748 Kb )

Licence: CC NC ND 2.0

Abstract

This last decade knew a strong passion for the complex microfloras particularly for the floras associated symbiotically with their host like the digestive tract flora. The digestive floras indeed open many opportunities as well on the medical level as on the industrial and the biotechnological levels. In this manuscript, various works on the digestive flora of Galliforms are presented: study of the antibiotic action mode as growth promoter in chicken, search for substitutes to antibiotics in chicken and search of a putative pathogen of non specific enteritis in turkey. New tools useful for the bacterial identification were also developed in this writing. A new technique of clone screening, named CSbyDG, based on a discrimination of tri-band DGGE profiles, proved its effectiveness to screen clone libraries of 16S rDNA. To allow the regrouping of profile obtained in CSbyDG, a data-processing program coded in Visual Basic Application for Excel was developed. This program, named ProReg XL Tool, is able to regroup identical electrophoretic profiles. Its applicability is thus much broader than the only regrouping of profile of CSbyDG. In the long term, CSbyDG should allow, by various bearings, to identify a bacterium in a few hours.

References

MASSIAS Bastien. Développement et Mise au Point d’Outils Moléculaires pour l’Identification des Flores Complexes Bactériennes – Application à l’Etude des Flores Digestives de Galliformes, 367 p. Thèse : Microbiologie : AgroParisTech : 2008.

Table of content

INTRODUCTION GENERALE - 8

CHAPITRE INTRODUCTIF

I. Vie symbiotique : vocabulaire et définition  -  13 

I. A. Les grands types de symbiose  -  14 

I. A. 1. La symbiose vraie  -  14 

I. A. 2. Le mutualisme : la symbiose facultative  -  15 

I. A. 3. La syntrophie: le mutualisme bactérien  -  15 

I. A. 4. Le commensalisme ou les compagnons de table  -  16 

I. A. 5. L’amensalisme : l’antagoniste du commensalisme  - 17 

I. A. 6. Le saprophytisme ou l’art de recycler la matière organique  -  18 

I. A. 7. Le parasitisme: entre symbiose et prédation  -  19 

I. A. 7. La phorésie : le transport en commun symbiotique  -  21 

I. A. 8. L’inquilinisme : une association spatiale sans exigence physiologique  -  21 

I. A. 9. L’opportunisme  -  22 

I. A. 10. La métabiose : un opportunisme très spécialisé  -  22 

I. B. Flores digestives et symbiose  -  23 

II. Les microflores du tractus digestif et leur modulation  -  28 

II. A. Les microflores complexes  -  28 

II. A. 1. Exemples de microflores complexes  -  28 

II. A. 2. Les microflores digestives  -  29 

II. A. 2.a. Flore digestive de l’Homme  -  30 

II. A. 2.b. Flores digestives des Galliformes (poulet et dinde)  -  32 

II.B. Les antibiotiques : modulateurs des flores digestives  -  33 

II.B.1. Les antibiotiques en production animale  -  33 

II.B.1.a. Les antibiotiques comme facteurs de croissance  -  33 

II.B.1.b. Mode d’usages des antibiotiques chez les animaux d’élevage  -  34 

II.B.1.c. Réglementation sur l’usage des antibiotiques en élevage  -  34 

II.B.2. Problématique de l’interdiction des antibiotiques en élevage animal  -  35 

II.B.2.a. Quelques chiffres sur la consommation d’antibiotiques  -  35 

II.B.2.b. Apparition des bactéries multi-résistantes  -  36 

II.B.2.c. Interdictions des usages zootechniques des antibiotiques  -  36 

II.B.2.d. Alternatives aux antibiotiques comme facteurs de croissance  -  37 

II.B.2.d.α. Les huiles essentielles  -  38 

II.B.2.d.β. Les probiotiques  -  39 

II.B.2.d.γ. Les prébiotiques  -  40 

III De l’art de l’identification bactérienne  -  41 

III. A. Identification bactérienne par approche morphologique  -  41 

III.B. Identification bactérienne par approche moléculaire  -  42 

III.B.1. Identification bactérienne par génies biochimique et immunologique  -  42 

III.B.2. Identification bactérienne par phylogénétique  -  43 

III.B.2.a. Histoire, définition et usage des études phylogénétiques  -  43 

III.B.2.a.α. la biomolécule comme horloge moléculaire de l’évolution  -  43 

III.B.2.a.β. Du choix de la bonne sémantide  -  44 

III.B.2.a.γ. l’ADNr 16S comme sémantide bactérienne  -  44 

III.B.2.a.δ. Autres sémantides bactériennes  -  45 

III.B.2.a.ε. Et en dehors du règne bactérien ?  -  46 

III.B.2.b. Identification bactérienne avec amorces oligonucléotidiques  -  47 

III.B.2.b.α. Les électrophorèses avec gradient dénaturant : TTGE/DGGE  -  47 

III.B.2.b.β. La tRFLP  -  50 

III.B.2.b.γ. L’amplification semi-quantitative et quantitative  -  51 

III.B.2.b.δ. Le clonage  -  52 

III.B.2.c. Identification bactérienne avec sondes oligonucléotidiques  -  52 

III.B.2.c.α. Hybridation in situ - Dot-Blot / Slot-Blot / FISH  -  53 

III.B.2.c.β. Puces à ADN – Microarray  -  53 

 

CHAPITRE DEUX : Etudes des flores digestives de Galliformes

II. A Mise au point du protocole de DGGE  -  59 

II.B. Matériel et Méthodes  -  61 

II.B.1. Matériel biologique  -  61 

II.B.2. Extraction des ADN bactériens  -  61 

II.B.3. Amplification d'ADN in vitro  -  61 

II.B.4. DGGE  -  63 

II.B.5. Séquençage des bandes  -  63 

II.B.6. Réalisation des dendrogrammes  -  64 

II.B.7. Identification phylogénétique  -  64 

II.B.8. Clonage  -  64 

II.B.9. Arbre phylogénétique  -  65 

II.B.10. Analyses statistiques  -  65 

II.C. Mode d’action des antibiotiques en alimentation animale  -  65 

II.C. 1. Propos introductifs  -  65 

II.C.2. Précision sur le matériel biologique  -  66 

II.C.3. Résultats et discussion  -  67 

II.D. Action de substances non-antibiotiques sur les flores digestives du poulet  -  68 

II.D.1. Propos introductifs  -  68 

II.D.2. Précisions sur les substances non antibiotiques testées  -  69  

II.D.3. Résultats et discussion  -  69 

II.D.3.a. Amorçage lactobacille  -  69 

II.D.3.b. Amorçage eubactérien  -  70 

II.E. Recherche d’un pathogène digestif putatif de la dinde  -  71 

II.E.1. Propos introductifs  -  71 

II.E.2. Précision sur le matériel et méthodes  -  72 

II.E.3. Résultat et discussion  -  73 

 

CHAPITRE TROIS : Apports à l’identification bactérienne et aux études environnementales

III. A. Introduction  -  77 

III.A.1. Limites des études bactériennes par gels à gradient dénaturant  -  77 

III.A.2. Mise au point de la CSbyDG et du programme ProReg XL Tool  -  78 

III.B. ProReg XL Tool : un outil de regroupement de profils électrophorétiques  -  79 

III.B. 1. Introduction du programme ProReg XL Tool  -  79 

III. B. 2. Conclusion sur le programme ProReg XL Tool  -  92 

III. B. 3. Détails sur les perspectives possibles de ProReg XL Tool  -  92 

III. B. 3. a. Les diverses options supplémentaires envisageables  -  93 

III. B. 3. b. Le réencodage de ProReg XL Tool  -  95 

III. B. CSbyDG : une nouvelle stratégie de criblage de clones  -  96 

III. B. 1. Introduction sur la technique CSbyDG  -  96 

III. B. 2. Conclusion sur la technique CSbyDG  -  118 

III. B. 3. Perspectives d’utilisation de la technique de CSbyDG  -  118 

III. C. CSbyDG database : une suite logique à la CSbyDG  -  119

 

CONCLUSION GENERALE - 123

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 127

ANNEXES - 148

Statistiques de consultation

Repository Staff Only: edit this item