Blanc, Fany (2008) Development of a cell-based assay of the elicitation of the allergic reaction. Assessment of the allergenicity of milk and peanut proteins and of the effects of heat treatments on the allergenitcity of Ara h 1. PhD thesis Biologie, INRA, UR 0496 Unité d’Immuno-Allergie Alimentaire, AgroParistech 2008AGPT0078 p.266.

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Abstract

IgE-mediated food allergies to peanut and milk represent a major health issue particularly in

children. Cross linking of specific IgE bound on basophils and mast cells by the allergen is a critical

step for the elicitation of an allergic reaction. A cell-based assay has been developed to analyse the

capacity of an allergen to induce the mediator release by those cells when interacting with IgE bound

on their membrane. The assay uses cell line RBL SX-38 developed by JP Kinet derived from rat mast

cells engineered to express the human high affinity receptor for IgE. The development of the assay in a

96-well format has required the optimization of various parameters involved in both the cell

sensitization step using IgE from peanut allergic patients and the cell activation step by the

corresponding allergen. This test has confirmed the degranulation potential of all milk and peanut

proteins, and in particular of milk casein and peanut 2S albumins, Ara h 2 and Ara h 6, corroborating

the available clinical observations.

In the frame of the European program EuroPrevall, we have evaluated the impact of thermal

treatments on allergenicity of Ara h 1. Our results have shown that allergenicity of Ara h 1 is

decreased when the purified protein is heated in solution, but is increased during roasting of peanut

because of interactions between Ara h 1 and food matrix constituents.

This cell-based test thus demonstrated to be a relevant tool to study the biological

consequences of the interactions between allergens and IgE. It makes possible to better understand the

relationship between the structure of a food protein and its allergenicty and, hopefully, to assess the

allergenicity of new foods without requiring provocation tests on patients.

Table of content

INTRODUCTION GENERALE - 19

I. L’ALLERGIE ALIMENTAIRE - 19

I.1. L’allergie alimentaire : définitions, prévalence et symptômes - 20

I.1.1. Définitions et classifications - 20

I.1.2. Prévalence de l’allergie alimentaire - 23

I.1.3. Symptômes cliniques - 24

I.1.4. Facteurs influençant la survenue d’une réaction allergique alimentaire - 26

I.1.4.1. Facteurs génétiques - 26

I.1.4.2. Facteurs environnementaux et hypothèse hygiéniste - 27

I.1.4.3. Autres facteurs - 28

I.2. Acteurs et mécanisme de l’allergie alimentaire de type I - 29

I.2.1. Les acteurs de l’allergie alimentaire - 29

I.2.1.1. Les IgE et les récepteurs aux IgE - 29

I.2.1.1.a. Les IgE - 29

I.2.1.1.b. Le récepteur de haute affinité pour les IgE (FcRI) - 31

I.2.1.1.c. La liaison de l’IgE au FcRI - 33

I.2.1.1.d. Régulation de l’expression du FcRI - 33

I.2.1.1.e. Le récepteur de faible affinité pour les IgE (FcRII ou CD23) - 34

I.2.1.2. Les cellules effectrices de l’allergie - 34

I.2.1.2.a. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) - 34

I.2.1.2.b. Les lymphocytes T auxiliaires et T régulateurs - 35

I.2.1.2.c. Les lymphocytes B - 38

I.2.1.2.d. Les granulocytes - 38

I.2.1.2.d.i. Basophiles - 38

I.2.1.2.d.ii. Mastocytes - 38

I.2.1.2.d.iii. Eosinophiles - 39

I.2.2. Le mécanisme de l’allergie alimentaire - 40

I.2.2.1. Franchissement de la barrière mucosale - 40

I.2.2.2. Phase de sensibilisation - 41

I.2.2.3. Phase de déclenchement - 43

I.2.2.3.a. Pontage des IgE et dégranulation des cellules effectrices - 43

I.2.2.3.b. Phase précoce - 44

I.2.2.3.c. Phase tardive - 45

I.3. Les allergènes alimentaires - 46

I.3.1. Principaux allergènes alimentaires - 46

I.3.2. L’allergie à l’arachide - 48

I.3.2.1. Prévalence et caractéristiques cliniques - 48

I.3.2.1.a. Prévalence et histoire naturelle - 48

I.3.2.1.b. Tableau clinique - 49

I.3.2.1.c. Dose réactogène - 50

I.3.2.1.d. Allergies croisées - 51

I.3.2.2. Les allergènes de l’arachide - 51

I.3.2.2.a. Les protéines d’arachide - 51

I.3.2.2.b. Les allergènes identifiés de l’arachide - 52

I.3.3. L’allergie au lait de vache - 55

I.3.3.1. Prévalence et caractéristiques cliniques - 56

I.3.3.1.a. Prévalence et histoire naturelle - 56

I.3.3.1.b. Tableau clinique - 56

I.3.3.1.c. Dose réactogène - 57

I.3.3.1.d. Réactions croisées - 57

I.3.3.2. Les allergènes du lait de vache - 58

I.3.3.2.a. Les protéines du lait de vache - 58

I.3.3.2.b. Les allergènes identifiés dans le lait de vache - 60

I.3.4. L’allergie à la noisette - 61

I.3.4.1. Prévalence et caractéristiques cliniques - 61

I.3.4.1.a. Prévalence - 61

I.3.4.1.b. Tableau clinique - 62

I.3.4.2. Les allergènes de la noisette - 62

I.3.5. Conclusion - 64

II. ETUDE IN VIVO ET IN VITRO DE L’ALLERGENICITE

DES ALIMENTS - 65

II.1. Outils d’évaluation de l’allergénicité - 65

II.1.1. Tests in vitro de la réactivité des IgE - 66

II.1.1.1. Etude de la liaison IgE-allergène - 66

II.1.1.1.a. Immunoempreinte - 66

II.1.1.1.b. Dosage des IgE spécifiques - 66

II.1.1.2. Etude sur cellules effectrices - 68

II.1.2. Modèles animaux - 69

II.1.2.1. Evaluation du pouvoir sensibilisant - 69

II.1.2.2. Evaluation du pouvoir déclenchant - 70

II.1.3. Tests de provocation chez l’homme - 72

II.1.3.1. Tests cutanés - 72

II.1.3.2. Test de provocation orale - 73

II.2. Effet des traitements sur l’allergénicité des aliments - 74

II.2.1. Digestion - 75

II.2.1.1. Effet de la digestion sur l’allergénicité des allergènes vrais - 76

II.2.1.2. Effet de la digestion sur l’allergénicité des allergènes incomplets - 78

II.2.2. Traitements thermiques - 80

II.2.2.1. Effet du chauffage sur les allergènes purifiés - 81

II.2.2.2. Effet de la génération de produits de la réaction de Maillard au cours

du chauffage - 82

II.2.2.3. Effet du chauffage sur l’aliment entier - 82

II.2.2.4. Impact sur la digestibilité - 84

II.2.3. Autres procédés industriels - 84

II.2.3.1. Diminution du potentiel allergénique - 84

II.2.3.2. Conservation/protection du potentiel allergénique - 85

II.2.3.3. Augmentation du potentiel allergénique et/ou formation de

néoallergènes - 85

II.2.4. Matrice alimentaire - 86

III.CONCLUSION ET OBJECTIFS DE LA THESE - 88

PREMIERE PARTIE : DEVELOPPEMENT ET

OPTIMISATION D’UN MODELE CELLULAIRE DE

DECLENCHEMENT DE LA REACTION ALLERGIQUE - 91

I. INTRODUCTION - 92

I.1. La lignée cellulaire d’origine : RBL 2H3 - 92

I.2. Humanisation des cellules RBL 2H3 - 92

I.3. La lignée cellulaire RBL SX-38 - 93

II. MATERIELS ET METHODES - 95

II.1. Purifications des allergènes des laits de vache et de chèvre et de l’arachide - 95

II.1.1. Purification des allergènes des laits de vache et de chèvre - 95

II.1.2. Purification des allergènes de l’arachide - 98

II.2. Sérums de patients allergiques - 99

II.2.1. Sérums de patients allergiques à l’arachide - 100

II.2.2. Sérums de patients allergiques au lait - 101

II.3. Dosages enzymo-immunologiques des IgE totales et des IgE spécifiques et

dosage des complexes IgE-IgG présents dans les sérums - 102

II.3.1. Matériels et tampons utilisés - 102

II.3.1.1. Matériels d’immunoanalyse utilisés - 102

II.3.1.2. Tampons utilisés - 103

II.3.2. Préparation des plaques de microtitration avec l’anticorps ou l’antigène

immobilisé - 103

II.3.3. Préparation des traceurs - 104

II.3.4. Dosages enzymo-immunologiques des anticorps présents dans les sérums... 104

II.3.4.1. Dosage des IgE totales - 104

II.3.4.2. Détection des IgE spécifiques - 105

II.3.4.2.a. Dosage par immobilisation de l’allergène - 105

II.3.4.2.b. Détection par capture d’IgE - 105

II.3.4.3. Dosage des complexes IgE-IgG - 106

II.4. Modèle cellulaire - 106

II.4.1. Conditions de culture des cellules RBL SX-38 et RBL 2H3 - 106

II.4.1.1. Milieu de culture - 106

II.4.1.2. Repiquage des cellules - 107

II.4.1.3. Numération et détermination de la viabilité cellulaire - 107

II.4.1.4. Congélation/décongélation - 107

II.4.1.5. Sous-clonage par dilutions limites - 108

II.4.2. Expression du récepteur aux IgE humaines par les cellules RBL SX-38 - 108

II.4.2.1. Contrôle de l’expression de la chaîne du FcRI humain par

cytométrie en flux - 108

II.4.2.2. Contrôle de l’expression de la chaîne du FcRI humain - 109

II.4.3. Test de dégranulation - 111

II.4.3.1. Ensemencement des cellules - 111

II.4.3.2. Sensibilisation passive des cellules - 112

II.4.3.3. Activation des cellules - 113

II.4.3.4. Dosage des médiateurs libérés - 114

II.4.3.5. Contrôles réalisés lors des tests de dégranulation - 115

II.4.3.6. Expression des résultats - 115

III.RESULTATS ET DISCUSSION - 117

III.1. Mise au point du modèle cellulaire de dégranulation avec les cellules RBL

SX-38 - 117

III.1.1. Choix du médiateur dosé pour évaluer la dégranulation des cellules - 117

III.1.2. Sous-clonage de la lignée et sélection du meilleur clone - 119

III.1.2.1. Expression de la chaîne du FcRI par les différents clones - 120

III.1.2.2. Evaluation de la capacité de dégranulation des différents clones - 121

III.1.2.3. Caractérisation du clone sélectionné - 122

III.1.3. Adaptation du test cellulaire de dégranulation au format 96 puits - 124

III.1.4. Optimisation de l’étape de sensibilisation - 125

III.1.4.1. Amélioration de la sensibilité et de la reproductibilité du test par

prétraitement des sérums humains - 125

III.1.4.2. Optimisation de la quantité d’IgE - 129

III.1.4.3. Optimisation du volume de milieu dans lequel sont diluées les IgE - 130

III.1.4.4. Durée d’incubation des IgE avec les cellules - 130

III.1.5. Optimisation de l’étape d’activation - 131

III.1.5.1. Durée d’incubation avec les activateurs - 131

III.1.5.2. Dégranulation de référence - 131

III.1.6. Bilan des conditions expérimentales optimales pour le test cellulaire de

dégranulation - 133

III.1.7. Discussion sur la mise au point du modèle cellulaire de dégranulation - 135

III.2. Applications du modèle cellulaire - 138

III.2.1. Etude des allergènes du lait - 138

III.2.1.1. Confirmation de la fonctionnalité des allergènes purifiés - 138

III.2.1.2. Comparaison du potentiel de dégranulation des allergènes purifiés des

laits de vache et de chèvre - 142

III.2.1.2.a. Caractéristiques des sérums utilisés - 142

III.2.1.2.b. Profil des courbes de dégranulation induites par les différents

allergènes des laits de vache et de chèvre - 144

III.2.1.2.c. Analyse des intensités des dégranulations obtenues :

correspondance avec l’intensité de la réponse IgE spécifique - 147

III.2.1.2.d. Doses d’allergènes induisant les dégranulations - 149

III.2.1.2.e. Conclusions et discussion - 151

III.2.2. Etude des allergènes purifiés de l’arachide - 154

III.2.2.1. Comparaison du potentiel de dégranulation de différents allergènes

purifiés de l’arachide - 154

III.2.2.1.a. Caractéristiques des sérums utilisés - 154

III.2.2.1.b. Profils des courbes de dégranulation - 156

III.2.2.1.c. Intensités des dégranulations - 159

III.2.2.1.d. Doses d’allergènes induisant les dégranulations - 162

III.2.2.2. Liens entre capacité à dégranuler et caractéristiques immunochimiques

des sérums et cliniques des patients - 164

III.2.2.2.a. Pourcentages en IgE spécifiques vs IgE totales des sérums et

intensités de dégranulation - 164

III.2.2.2.b. Existe-t-il un lien entre la capacité des sérums à dégranuler les

cellules et la symptomatologie du patient ? - 167

III.2.2.2.c. Les complexes IgE-IgG présents dans les sérums ont-ils une

influence sur le test de dégranulation ? - 168

III.2.2.3. Conclusions - 174

IV. CONCLUSIONS ET DISCUSSION GENERALE - 177

SECONDE PARTIE : EFFET DE TRAITEMENTS

THERMIQUES SUR L’ALLERGENICITE DE LA

GLOBULINE 7S DE L’ARACHIDE (Ara h 1) - 181

I. INTRODUCTION - 181

II. MATERIELS ET METHODES - 183

II.1. Purifications et modifications des allergènes - 183

II.2. Données cliniques des patients allergiques recrutés et caractérisations

immunologiques de leurs sérums - 183

II.3. Etude de la capacité de liaison des allergènes naturels/modifiés aux IgE de

patients allergiques - 188

II.3.1. Dosage des IgE spécifiques humaines - 188

II.3.1.1. Dosage des IgE spécifiques par EAST - 188

II.3.1.2. Détection des IgE spécifiques par capture des IgE - 189

II.3.2. Etude de la capacité de liaison des allergènes aux IgE de patients

allergiques - 189

II.4. Etude in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes naturels ou

modifiés à l’aide des IgE humaines - 190

II.5. Etude in vivo et in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes

naturels/modifiés chez la souris BALB/c - 190

II.5.1. Souris - 192

II.5.2. Sensibilisation expérimentale - 192

II.5.2.1. Immunisation en AIF - 192

II.5.2.2. Immunisation en alum - 192

II.5.3. Confirmation de la sensibilisation - 193

II.5.3.1. Dosage enzymo-immunologiques des IgE, IgG1 et IgG2a totales et

spécifiques de Ara h 1 - N - 193

II.5.3.2. Dosage des cytokines Th1/Th2 sécrétées par les splénocytes des souris

immunisées - 194

II.5.3.2.a. Mise en culture et réactivation des splénocytes - 194

II.5.3.2.b. Dosage des cytokines Th1/Th2 - 195

II.5.4. Etude de la capacité de liaison des allergènes naturels/modifiés aux IgE de

souris sensibilisées expérimentalement - 195

II.5.5. Etude in vitro du potentiel de déclenchement des allergènes naturels ou

modifiés à l’aide des IgE de souris sensibilisées expérimentalement - 196

II.5.6. Test de déclenchement in vivo chez la souris sensibilisée

expérimentalement - 197

II.5.6.1. Mesure des paramètres de la réaction allergique immédiate - 197

II.5.6.1.a. Test de provocation et prélèvement des LBA - 198

II.5.6.1.b. Dosages des leucotriènes et des prostaglandines dans les LBA - 198

II.5.6.2. Mesure des paramètres de la réaction tardive - 199

II.5.6.2.a. Test de provocation et prélèvement des LBA - 199

II.5.6.2.b. Analyse de l’influx cellulaire dans les LBA - 199

II.5.6.2.c. Dosage des cytokines Th1/Th2 dans les LBA - 200

II.5.7. Analyses statistiques - 200

III.RESULTATS ET DISCUSSION - 201

III.1. Analyse des profils de sensibilisation aux albumines 7S de l’arachide, de la

noisette, du soja et du pois chez les patients allergiques - 201

III.1.1. Dosages des IgE spécifiques de la globuline 7S du pois et du soja dans les

sérums de patients allergiques - 201

III.1.2. Profils de sensibilisation aux allergènes de noisette selon l’origine

géographique des patients - 201

III.1.3. Sensibilisation des patients allergiques à l’arachide - 203

III.1.4. Conclusions et nouveaux objectifs - 205

III.2. Effets des traitements thermiques sur l’allergénicité de la globuline 7S de

l’arachide (Ara h 1) - 206

III.2.1. Evaluation de l’effet de traitements thermiques sur la capacité de liaison

aux IgE de patients allergiques à l’arachide - 207

III.2.1.1. Analyse des IgE spécifiques par dosage EAST - 207

III.2.1.2. Analyse par test d’inhibition en capture d’IgE - 208

III.2.1.2.a. Détection des IgE spécifiques de Ara h 1 - N en capture d’IgE - 208

III.2.1.2.b. Tests de compétitions de Ara h 1 - N vs Ara h 1 - C et - CG en

capture d’IgE - 209

III.2.2. Effet des traitements thermiques sur la capacité de dégranulation de

cellules effectrices sensibilisées par les IgE de patients allergiques - 211

III.2.3. Effet des traitements thermiques sur le potentiel de déclenchement de la

réaction allergique chez des souris sensibilisées expérimentalement - 214

III.2.3.1. Evaluation de la sensibilisation des souris - 214

III.2.3.1.a. Dosages des IgE, IgG1 et IgG2a induites - 214

III.2.3.1.b. Dosages des cytokines Th1/Th2 sécrétées ex vivo - 216

III.2.3.2. Etude de la capacité de liaison des IgE spécifiques induites à Ara h 1

naturelle et modifiée - 217

III.2.3.3. Tests de déclenchement in vitro à l’aide de sérums de souris

sensibilisées expérimentalement - 219

III.2.3.4. Induction du déclenchement de la réaction allergique in vivo - 221

III.2.3.4.a. Analyse des marqueurs précoces de la réaction allergique - 221

III.2.3.4.b. Analyse des marqueurs de la réaction tardive - 222

III.2.3.5. Conclusions - 226

IV. CONCLUSIONS ET DISCUSSION - 228

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES - 231

BIBLIOGRAPHIE - 235

ANNEXES - 267

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