Daou, Nadine (2008) Identifcation of new hosts-dependants factors in Bacillus cereus Molecular and functional characterization of IlsA, a surface protein essential for iron acquisition during infection. PhD thesis Microbiologie, INRA Centre de Versailles-Grignon UR1249 Unité Génétique Microbienne et Environnement, Laboratoire de Biotechnologie Faculté des Sciences Université Saint-Joseph de Beyrouth, AgroParistech 2008AGPT0068 p.169.

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Abstract

Bacillus cereus is frequently associated with food-borne gastroenteritis and can be responsible for severe opportunistic infections. Adaptation factors involved in the pathogenicity of B. cereus are still unknown. The ability to acquire ion during infection, is an important adaptation factor that allow bacteria to overcome the lack of iron imposed by the host.

Our work has led to the identification of new factors involved in the adaptation of B. cereus in the host and to the characterization of a novel protein IlsA (Iron regulated leucine-rich surface protein) highly expressed in the host. These factors were identified using the IVET (In Vivo Expression Technology) system, which was adapted to the strain B. cereus ATCC 14579 and screened after infection in the insect larvae Galleria mellonella. This system detects transient activated promoters.

The protein structure analysis of IlsA shows four distinct domains: an N-terminal signal peptide for export, a NEAT domain thought to be involved in iron transport, a leucine-rich repeat domain that may interact with host cells, and an SLH domain presumably binding the protein to the bacterial surface. The presence of a fur box in the promoter region of ilsA suggests an iron dependent regulation. Indeed, the transcriptional analysis showed that ilsA is expressed under iron restricted conditions in vitro and in vivo. In addition, we have shown that IlsA is located on the bacterial surface and that is required for iron acquisition from the host proteins: hemoglobin, heme and ferritin, by direct binding to them. Furthermore, the protein sequence of the NEAT domain of IlsA, suggests that it could be responsible for the interaction with the heme. Disruption of ilsA reduced the survival and the virulence of B. cereus in the insect and in a mice macrophage cell line.

Our results indicate that IlsA is an adaptation factor that play an essential role in iron acquisition during infection and thus contribute to the pathogenesis of B. cereus in both invertebrates and vertebrates

Table of content

INTRODUCTION - 4

Chapitre I – Bacillus cereus, Généralités et Virulence - 5

1 Généralités - 6

1.1 Historique - 6

1.2 Caractères généraux - 6

1.3 Phylogénie du groupe B. cereus - 7

2 Les facteurs de virulence du groupe B. cereus - 8

2.1 Pathogénécité spécifique des espèces du groupe B. cereus - 9

2.1.1 Bacillus anthracis - 9

2.1.2 Bacillus thuringiensis - 9

2.1.3 Bacillus cereus - 11

2.2 Facteurs de virulence communs au groupe B. cereus - 12

2.2.1 Les entérotoxines - 12

2.2.2 Les phospholipases - 13

2.2.3 Les hémolysines - 13

2.2.4 Les protéases - 14

2.3 Régulation de l’expression des facteurs de virulences - 14

2.4 Autres facteurs de virulence - 15

Chapitre II - Le fer : transport et régulation chez les bactéries - 16

1 Introduction - 16

2 Sources de fer chez l’hôte - 17

2.1 Transferrine et lactoferrine - 17

2.2 Ferritine - 17

2.3 L’hème - 18

2.4 L’hémoglobine - 18

2.5 Autres hémoprotéines - 18

3 Rôle du fer dans les interactions hôte-bactéries - 19

3.1 Limitation du fer chez les mammifères - 19

3.2 Limitation du fer chez l’insecte - 20

3.3 Acquisition du fer par les bactéries - 21

3.3.1 Acquisition indirecte - 21

3.3.2 Acquisition directe - 22

4 Mécanismes de transport du fer à travers les membranes biologiques des bactéries - 23

4.1 Mécanismes de transport du fer chez les bactéries à Gram négatif - 23

4.2 Mécanismes généraux de transport du fer chez les bactéries à Gram positif - 24

4.2.1 Mécanismes de transport des sidérophores - 24

4.2.2 Mécanismes de transport des sources de fer présentes chez l’hôte - 25

5 Exemples des systèmes d’acquisition de fer chez les bactéries à Gram positif - 25

5.1 Staphylococcus aureus - 26

5.1.1 Systèmes indirects d’acquisition de fer - 26

5.1.2 Systèmes directes d’acquisition de fer - 26

5.2 Listeria monocytogenes - 28

5.3 Bacillus anthracis - 29

5.3.1 Systèmes indirects d’acquisition de fer - 29

5.3.2 Système direct d’acquisition d’hème comme source de fer - 30

5.4 Bacillus cereus - 30

6 Régulation et homéostasie du fer chez les bactéries - 31

RESULTATS - 35

Objectifs du projet de thèse - 36

I. Un nouvel outil: le système IVET - 37

1 Caractéristiques et principe du système IVET - 38

2 Criblage des gènes de B. cereus exprimés au cours de l’infection - 39

3 Identification des gènes potentiellement exprimés au cours de l’infection - 40

II. Le gène ivi29 - 40

1 Caractéristiques moléculaires du gène ivi29 et de son produit - 40

2 Rôle d’IlsA in vivo - 42

2.1 Expression d’ilsA in vivo en interaction avec le tissu de l’hôte - 42

2.2 Effet d’IlsA sur la virulence de B. cereus ATCC 14579 vis-à-vis de Galleria

mellonella - 42

3 Rôle d’IlsA dans l’acquisition du fer chez l’hôte - 43

3.1 Régulation d’ilsA par le fer - 43

3.2 Identification des sources de fer de l’hôte interagissant avec IlsA - 44

3.3 Analyse de l’interaction d’IlsA avec les sources de fer - 45

3.4 Localisation d’IlsA à la surface par immunomarquage - 46

4 Rôle d’IlsA dans la virulence chez les mammifères - 47

4.1 Test de cytotoxicité et de cinétique de croissance chez les macrophages J774 - 47

4.2 Cinétique de croissance dans le sang de porc - 48

Article 1 - 49

Article 2 - 50

RESULTATS COMPLEMENTAIRES - 51

I. Recherche des partenaires bactériens d’IlsA - 52

1 Pull down - 52

2 Rôle d’un ABC transporteur situé à proximité d’IlsA - 52

3 Etude protéomique - 53

II. Le gène ilsB : - 54

1 Expression d’ilsB in vivo - 54

2 Expression d’ilsB in vitro en absence de fer - 55

3 Effet du gène ilsB sur la virulence chez G. mellonella - 55

III. Rôle d’IlsA et IlsB dans la formation de biofilm in vitro - 56

DISCUSSION ET PERSPECTIVES - 57

I. Le système IVET : un nouvel outil génétique chez B. cereus - 58

II. IlsA, une protéine clé d’un nouvel mécanisme d’acquisition de fer - 58

1 IlsA et acquisition du fer - 59

2 IlsA et transport du fer - 61

3 IlsA, adaptation et virulence chez l’hôte - 62

4 Modèle représentant le rôle de IlsA dans l’acquisition du fer chez l’hôte - 63

III. B. cereus et fer…………………………………………………………………………65

REFERENCES - 66

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