Simon-deckers, Angélique (2008) Biological effects of manufactured nanoparticles : influence of their charactéristics. PhD thesis Biologie spécialité Toxicologie humaine et environnementale, CEA Saclay, UMR9956 , Laboratoire Pierre Süe, AgroParistech 2008AGPT0081 p.280.
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Abstract
Development of nanosciences and nanotechnologies may lead to considerable release of nanoparticles in the environment, potentially toxic for ecosystems and human health. Therefore, nanotoxicology attracts attention of public and governments worldwide. In this work comparative in vitro toxicological assessment, cellular localization and oxidative stress of titanium oxide nanoparticles and carbon nanotubes was carried out on one eukaryotic model, the human pneumocyte II A549 cell line allowing to simulate contact after
inhalation, and on two prokaryotic model, Escherichia coli MG1655 and the soil bacterium Cupriavidus metallidurans CH34 allowing to simulate contamination of the environment. Results show biological responses to nanoparticles which depends on models, on exposure‘s conditions and on physico-chemical
characteristics of nanoparticles.
| Item Type: | PhD Thesis (PhD) |
|---|---|
| PhD Supervisor: | Reynaud, Cécile |
| Date: | 05 December 2008 |
| Board of examiners: | Bauda, Pascale and Boczkowski, Jorge and Carriere, Marie and Desqueyroux, Hélène and Ferrari, Roselyne and Tome, Daniel |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biologie spécialité Toxicologie humaine et environnementale |
| Collection (Fonds): | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Department: | CEA Saclay, UMR9956 , Laboratoire Pierre Süe |
| Subjects: | 7. Life Sciences and Engineering |
| Uncontrolled Keywords: | Nanoparticule, Oxyde métallique, Metal oxide, Nanoparticule, Nanotube de carbone, Bactéries, cellules A549, Caractéristiques physico-chimiques, Cytotoxicité, Localisation cellulaire, Stress oxydant, Metal oxide, Carbon nanotube, Bacteria, A549 cell, Physico-chemical characteritics, Cytotoxicity, Cellular localisation, Oxidative stress |
| ID Code: | 4918 |
| Deposited By: | Marina Briffaut |
| Deposited On: | 19 March 2009 |
Table of content
Introduction 1
1 Contexte de l’étude 3
1.1 Les nanoparticules manufacturées : un enjeu pour l’avenir ? - 5
1.1.1 Définition et intérêt - 5
1.1.1.1 Des propriétés nouvelles - 7
1.1.1.2 Les sources de nanoparticules - 8
1.1.1.3 Les méthodes de synthèse des nanoparticules manufacturées - 9
1.1.1.4 Les nanoparticules manufacturées : un marché promettant
de nombreuses applications - 10
1.1.2 Les nanoparticules d’oxyde métallique - 11
1.1.3 Les nanotubes de carbone - 13
1.2 Les risques pour l’homme et l’environnement - 15
1.2.1 Effets des nanoparticules sur l’environnement - 15
1.2.1.1 Voies de contamination de l’environnement et distribution
dans les différents compartiments écologiques
- 15
1.2.1.2 Risques pour les écosystèmes et les organismes les
constituant - 18
1.2.2 Effets des nanoparticules sur l’Homme - 19
1.2.2.1 Voies d’entrée dans l’organisme - 19
1.2.2.2 Translocation et devenir dans l’organisme - 22
1.2.2.3 Effets sur la santé humaine - 23
1.3 Effets biologiques des nanoparticules à l’échelle cellulaire et moléculaire
- 25
1.3.1 Effets chez les Procaryotes - 25
1.3.2 Effets chez les Eucaryotes - 28
1.3.2.1 Les nanoparticules d’oxyde métallique - 28
1.3.2.2 Les nanotubes de carbone - 30
1.4 Synthèse du chapitre - 32
Objectifs et démarche de l’étude 35
2 Matériels et méthodes 37
2.1 Nanoparticules étudiées et techniques de caractérisation - 39
2.1.1 Sources des nanoparticules - 39
2.1.2 Préparation des suspensions de nanoparticules - 40
2.1.3 Etat d’agglomération par spectroscopie par corrélation de
photon (SCP) - 42
2.1.4 Mesure du potentiel zêta - 44
2.1.5 Identification de la structure cristalline par DRX - 47
2.1.6 Analyse des éléments traces dissouts par ICP-MS - 49
2.1.7 Analyse élémentaire de la surface des nanoparticules par
EDS - 51
2.1.8 Surface spécifique et porosité par la méthode de BET - 52
2.2 Techniques de microbiologie - 54
2.2.1 Souches bactériennes - 54
2.2.2 Conditions de culture et suivi de croissance - 55
2.2.3 Evaluation de la viabilité cellulaire après exposition dans l’eau 57
2.2.3.1 Conditions d’exposition dans l’eau - 57
2.2.3.2 Les dénombrements sur milieu solide - 57
2.2.3.3 Le kit Live/Dead® BaclightTM - 58
2.3 Techniques de culture cellulaire - 60
2.3.1 Lignée cellulaire et culture - 60
2.3.2 Evaluation de la viabilité cellulaire : les différents tests de
cytotoxicité - 61
2.3.2.1 Le test MTT - 61
2.3.2.2 Le test XTT - 62
2.3.2.3 Le test au rouge neutre - 63
2.3.2.4 Le test à la résazurine - 64
2.3.2.5 Le test LDH - 64
2.3.2.6 Le test au bleu trypan - 65
2.3.3 Dosage des espèces réactives de l’oxygène par la sonde H2DCFDA
- 66
2.3.4 Dosage des systèmes intervenant dans la régulation du stress
oxydant - 67
2.3.4.1 Extraction des protéines cellulaires - 67
2.3.4.2 Dosage du glutathion total GSH - 67
2.3.4.3 Dosage de la glutathion peroxydase GPx - 68
2.3.4.4 Dosage de la glutathion réductase GRED - 69
2.3.4.5 Dosage de la superoxyde dimustase SOD - 70
2.3.4.6 Dosage de la catalase - 71
2.3.5 Evaluation de la génotoxicité - 72
2.3.5.1 le test des comètes en condition alcaline - 72
2.3.5.2 l’immunomarquage des histones
-H2AX - 73
2.3.5.3 le test des micronoyaux - 74
2.4 Techniques communes - 76
2.4.1 Dosage protéique par la méthode au BCA - 76
2.4.2 Observations au microscope électronique en transmission. . 76
2.4.2.1 La microscopie électronique en transmission (MET). 76
2.4.2.2 Préparation des échantillons - 78
2.5 Analyses statistiques - 79
3 Caractérisation des nanoparticules 81
3.1 Caractéristiques physico-chimiques - 83
3.1.1 Nature, forme et taille - 83
3.1.1.1 Les nanotubes de carbone (NtC) - 83
3.1.1.2 Les nanoparticules d’oxyde métallique - 87
3.1.2 Surface spécifique, évaluation de la taille, de la porosité et
de l’agrégation - 90
3.1.3 Charge surfacique et point isoélectrique - 92
3.1.4 Structure cristalline - 93
3.1.5 Analyse chimique de la surface des nanoparticules - 93
3.2 Préparation et stabilité des nanoparticules - 94
3.2.1 La dispersion des nanoparticules par sonication - 94
3.2.2 État de dispersion des nanoparticules - 97
3.2.2.1 Dans les suspensions mères aqueuses - 97
3.2.2.2 Évolution de l’état de dispersion dans les milieux
biologiques - 98
3.2.3 Dissolution en suspension aqueuse - 100
3.3 Interférences des nanoparticules avec les mesures optiques - 101
3.3.1 L’absorbance des nanoparticules - 101
3.3.2 Interférences avec les signaux de fluorescence - 101
3.4 Synthèse du chapitre - 104
4 Effet des nanoparticules sur la viabilité cellulaire 107
4.1 Effet cytotoxique des nanoparticules pour les bactéries - 109
4.1.1 Effets sur la croissance bactérienne - 109
4.1.2 Effets sur la viabilité bactérienne suite à une exposition aux
nanoparticules dans l’eau - 111
4.1.2.1 Les dénombrements sur boîte : une technique inadaptée
à nos conditions - 111
4.1.2.2 La technique du Live/Dead® BaclightTM - 113
4.2 Effet cytotoxique des nanoparticules pour les pneumocytes A549 . 118
4.2.1 Choix des tests de viabilité - 118
4.2.2 Effets des nanotubes de carbone sur la viabilité cellulaire . 120
4.2.3 Effets des nanoparticules d’oxyde métallique sur la viabilité
cellulaire - 123
4.3 Discussion - 126
4.3.1 Un effet cytotoxique avéré mais dépendant de différents paramètres
- 126
4.3.1.1 Pour les bactéries - 126
4.3.1.2 Pour les cellules pulmonaires - 128
4.3.2 Des effets spécifiques aux nanoparticules - 130
4.3.3 Une adsorption et/ou une accumulation des nanoparticules
chez les cellules A549 - 131
4.4 Synthèse du chapitre - 133
5 La localisation cellulaire des nanoparticules 135
5.1 Observations microscopiques des bactéries exposées aux nanoparticules
- 137
5.1.1 Interactions avec les nanotubes de carbone - 137
5.1.2 Interaction avec les nanoparticules d’oxyde métallique . . . 139
5.2 Observations microscopiques des pneumocytes exposés aux nanoparticules
- 144
5.2.1 Interactions avec les nanotubes de carbone - 144
5.2.2 Interactions avec les nanoparticules d’oxyde métallique . . . 145
5.3 Discussion - 150
5.3.1 Une pénétration de la paroi chez les bactéries - 150
5.3.2 Une accumulation cellulaire dans les pneumocytes, non dépendante
du type de nanoparticule - 154
5.4 Synthèse du chapitre - 156
6 Mécanismes d’action des nanoparticules 159
6.1 Nanoparticules et stress oxydant - 161
6.1.1 Le stress oxydant et les mécanismes de régulation de ce stress161
6.1.2 Stress oxydant induit dans les pneumocytes - 162
6.1.2.1 Dosage des espèces réactives de l’oxygène intracellulaires
- 162
6.1.2.2 Dosage des systèmes intervenant dans la régulation
du stress oxydant - 165
6.2 Nanoparticules et génotoxicité - 166
6.2.1 Les effets génotoxiques : définition et nature - 167
6.2.2 Le test des comètes - 167
6.2.3 Le test de l’immunomarquage de l’histone
-H2AX - 169
6.2.4 Le test des micronoyaux - 170
6.3 Discussion - 171
6.3.1 Une production d’ERO en présence de nanoparticules - 171
6.3.2 Un mécanisme de cytotoxicité non résolu - 176
6.3.3 Peu de cassures à l’ADN - 178
6.4 Synthèse du chapitre - 178
Conclusions et perspectives 181
Bibliographie 187
Abréviations 211
Glossaire 213
Liste des figures 222
Liste des tableaux 224
Annexes 225
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