López Kleine, Liliana (2008) Determination of the role of certain bacterial peptidases by inference from heterogeneous and incomplete data. PhD thesis Biologie et Statistiques Appliquées, UR477, Unité de Biochimie Bactérienne et UR341, Unité de Mathématiques et Informatique Appliquées,, AgroParistech 2008AGPT0056 p.198.

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Abstract

The determination of the role of proteins is at the origin of most biological studies. It becomes currently more important since the advent of genome sequencing, which provides a great number of proteins of unknown roles. The sequencing of new genomes allows at the same time to obtain high-throughput post-genomic data as for example microarrays data. It allows also the construction of phylogenetic profiles. The approach we have used, couples statistics and biology and integrates this post-genomic data in order to predict and further validate the role of putative proteolytic enzymes of Lactococcus lactis.



We worked in three different steps. First, we did a statistical inference of the predicted relationships between proteins of lactococci based on five different data sources: the graph of metabolic pathways, microarray data, phylogenetic profiles and the distance between genes in terms of base pairs on the chromosome and proteomic data from 2D gels. These relationships allowed us to pose biological hypotheses on the role of target proteins. Second, we carried out wet-lab experiments to validate the predictions comparing the wild type strain to knock-out mutants of PepF and YvjB. The third step consisted of a sensitivity analysis with the aim to outline the most important data in terms of contribution to the relationship prediction of our target proteins and to find a subset of data leading to the same predictions.



Applied to two proteolytic enzymes of lactococci, PepF and YvjB, this approach allowed us to validate their participation in protein export predicted by the statistical analysis. We have shown that PepF participates in the export of proteins liberated in the supernatant by the hydrolysis of the signal peptide, which is cleaved by the signal peptidase I. PepF participates also in the synthesis of the cell wall and pyruvate metabolism, two functions also predicted by the statistical analysis. YvjB participates in the localization and maturation of lipoproteins, another group of exported proteins. It is necessary for the correct localization of certain lipoproteins and participates in their signal peptide cleavage.

Our approach has shown to be very useful, as it allows to pose biological hypotheses that guide experimental validations. Moreover, this approach is applicable to all completely sequenced organisms for which enough post-genomic data is available.

Table of content

1. Introduction 1

2. Revue bibliographique 3

2.1 La protéolyse bactérienne 3

2.1.1 Classification des protéases et peptidases 3

2.1.2 Fonctions de la protéolyse chez les bactéries 6

2.1.2.1 La nutrition azotée 6

2.1.2.2 La dégradation des protéines mal repliées 8

2.1.2.3 La virulence 9

2.1.2.4 Le recyclage ou turnover des protéines 10

2.1.2.5 Protéolyse intermembranaire et régulatrice 10

2.1.2.6 Peptidases participant à la maturation et l’export des protéines 11

2.2 Les peptidases et protéases du lactocoque 11

2.2.1 Les peptidases et protéases participant principalement

à la nutrition azotée 13

2.2.2 Les peptidases dédiées aux fonctions autres que la

nutrition azotée 14

2.2.3 Les peptidases et protéases de Lactococcus lactis

de rôle inconnu ou mal connu 15

2.2.4 Les peptidases d’intérêt 16

2.2.4.1 PepF ou l’oligoendopeptidase F 16

2.2.4.2 YvjB ou Eep (enhanced expression of pheromone) 19

2.2.4.3 Yaih ou la prényl-peptidase CAAX 23

2.3 Prédiction du rôle des protéines 25

2.3.1 Approches existantes 25

2.3.1.1 Méthodes non supervisées et sans intégration de données 27

2.3.1.2 Méthodes supervisées et permettant l’intégration de données 32

2.3.1.3 Méthodes à noyaux 36

2.3.1.4 La KCCA : une méthode à noyaux supervisée qui permet

l’intégration de données 45

2.3.2 Analyse de sensibilité 48

2.3.2.1 Plan d’expériences 49

2.3.2.2 Analyse de variance sur la sortie 51

2.4 Thèmes concernant les rôles prédits pour les peptidases d’intérêt 52

2.4.1 Les protéines exportées 52

2.4.1.1 La synthèse des protéines exportées 53

2.4.1.2 La reconnaissance des protéines exportées 54

2.4.1.3 La translocation des protéines 56

2.4.1.4 Le peptide signal et son clivage 57

2.4.1.5 Hydrolyse du peptide signal 58

2.4.1.6 Les lipoprotéines 59

2.4.1.7 Les protéines ancrées 60

2.4.2 Structure du peptidoglycane 61

2.4.3 Métabolisme du pyruvate 63

Détermination du rôle de peptidases bactériennes/ Table de matières

LOPEZ KLEINE Liliana / 2008 / AgroParisTech

ii

3. Résultats de la KCCA 65

3.1 Reconstruction des liens connus des voies métaboliques 65

3.2 Reconstruction des liens connus : régulons et interactions

physiques entre protéines 65

3.3 Liens prédits et hypothèses sur le rôle des protéines cibles 67

4. Résultats des tests expérimentaux des liens prédits pour PepF 70

4.1 Article I: Role of bacterial peptidase F inferred by statistical analysis

and further experimental validation 70

4.2 L’export de protéines est affecté dans un mutant pepF, en conditions

de surproduction de protéines exportées 84

4.2.1 Analyse d’une lipoprotéine lors de la surproduction d’une protéine

sécrétée (NucB) 84

4.2.2 Analyse des protéines sécrétées (Usp45) lors de la surproduction

d’un substrat de la sortase 84

5. Résultats des tests expérimentaux des liens prédits pour YvjB (Eep) 87

5.1 Article II : YvjB, an Eep-like protein, is an essential partner of the signal peptidase II in the

maturation of certain lipoproteins in Lactococcus lactis 87

6. Résultats de l’analyse de sensibilité 108

6.1 Article III: Finding important data subsets for kernel-based

bacterial protein role predictions by performing a sensitivity analysis 110

6.1.1 Données supplémentaires de l’article III 116

6.2 Résultats de l’analyse de sensibilité sur YvjB 117

7. Matériels et Méthodes 119

7.1 Constructions génétiques 120

7.2 Protocoles de biologie moléculaire 122

7.3 Protocoles de microbiologie 126

7.4 Protocoles de biochimie et protéomique 127

7.5 Logiciels et obtention des données 130

Détermination du rôle de peptidases bactériennes/ Table de matières

LOPEZ KLEINE Liliana / 2008 / AgroParisTech

iii

7.6 Analyses statistiques 134

8. Discussion 136

9. Conclusions 142

10. Perspectives 142

11. Références 144

12. Présentations de ce travail 159

13. Annexes 161

Statistiques de consultation

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