Mostafa, Malecky (2008) The metabolism of terprenoides in caprins. PhD thesis Physiologie de la Nutrition Animale, INRA, UMR 791, AgroParistech 2008AGPT0032 p.205.

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Abstract

The main objective of this thesis is to study in vitro and in vivo the metabolism of some

terpenes characteristic of winter-spring ration ingested by dairy goats in the region of

Basilicata (Italy). We sought to quantify as the first step, the metabolism of terpenes in the

fermentation broth in vitro and to characterize the major variation factors of their metabolism.

We also conducted a test in vivo on 4 individual terpenes (-pinene, -pinene, p-cymène and

linalool, the main terpenes ingested by goats in Basilicata), in order to validate the results

obtained in vitro, to characterize their changes in the rumen, and their duodenal and blood

flow level. In parallel we have studied the impact of these terpenes on ruminal metabolism of

cell walls and protein, as well as their effects on the performance of dairy goats.

The experimental part is composed of three sets of studies. The methodological studies,

in vitro and in vivo studies of metabolism of terpenes. The methodological optimization

studies of an extraction and analysis method (SPME "Solid Phase Microextraction") have

been conducted in order to obtain the optimum conditions for the extraction of terpenes in the

fermentation broth and blood matrix.

The first in vitro essay led to a discrimination of tested terpene in terms of their

disappearance in the rumen juice, which has been associated to chemical type of considered

terpene. The hydrocarbons terpenes showed indeed a much greater disappearance compared

to oxygenated ones. This difference is mainly due to differences in their physico-chemical

properties, which separates in part their metabolic pathway. The disappearance of terpenes

appears to have two main causes, biological intervention of microbial origin and interaction

with the matrix. A lower toxic and higher hydrophobic property seems to reinforce the

microbial metabolism and the intervention of the matrix on hydrocarbon terpenes compared to

those oxygenated ones.

In the second test in vitro, the effect of three variables, the type of inoculum (rich in cell

walls vs. rich in starch), the type of bacteria (gramme positive vs gramme negative- selected

by the contribution of antibiotic) and the redox potential were studied on the metabolism of

terpenes in the fermentation broth. The results showed that the inoculum high in cell walls,

theoretically supporting cellulolytic bacteria increases the apparent degradation of terpenes.

The absence of an effect from the addition of the antibiotic eliminating gramme positive

bacteria showed that the gramme negative bacteria are principal responsible, which contribute

to the metabolism of terpenes. Finally, the increase in the redox potential increased the

disappearance of some of tested terpenes, especially in the inoculum rich in starch.

The results from in vitro studies on the metabolism of terpenes, were confirmed by those

observed in vivo. However a higher disappearance observed in vivo suggested the

involvement of other varying factors that can be attributed to the absorption in the rumen and

a loss from rumination and belching. The impact of terpenes on rumen metabolism and

performance of dairy goats was studied by incorporating a mixture of four terpenes

(mentioned above) at two doses (0.05 and 0.5 ml / kg DMI). Ingestion of terpenes did not

produce any effect on the ruminal metabolism of cell walls, and protein. The productivity

performance goats were not affected by terpenes, but a change in the milk protein content (a

drop in protein content at low dose) observed, can be considered as a secondary effect (effect

of dilution) linked to a numerically increase in the milk production at this dose level.

Table of content

1. Introduction générale 8

2. Partie bibliographique 12

2.1. Terpènes 13

2.1.1. Structure et propriétés physico-chimiques 13

2.1.1.1. Définition 13

2.1.1.2. Classification . 14

2.1.1.2.1. Hémiterpènes 14

2.1.1.2.2. Monoterpènes . 15

2.1.1.2.3. Sesquiterpènes 17

2.1.1.2.4. Diterpènes . 19

2.1.1.2.5. Sesterpènes . 19

2.1.1.2.6. Triterpènes 20

2.1.1.2.7. Tetraterpènes 20

2.1.1.2.8. Polyterpènes . 20

2.1.1.3. L’analyse des terpènes 21

2.1.1.3.1. L’échantillonnage et la préparation 21

2.1.1.3.1.1. Les méthodes d’extrcation classiques . 21

2.1.1.3.1.2. microextraction en phase solide (SPME) 22

2.1.1.3.1.2. Analyse chromatographique et identification . 27

2.1.2. La répartition des terpènes dans le monde vivant . 27

2.1.2.1. La biosynthèse des tetrpénoïdes dans le règne végétal . 28

2.1.2.1.1. La biosynthèse d’unité de base isoprène 28

2.1.2.1.2. Les organes végétaux synthétisant des tetrpénoïdes 28

2.1.2.2. Les fonctions biologiques de tetrpénoïdes 29

2.1.3. Les huiles essentielles et leur activité anti-microbienne . 30

2.1.3.1. Les facteurs déterminant le degré d’activité antimicrobienne des HES 31

2.1.3.1.1. Les méthodes d’évaluation d’activité antimicrobienne 31

2.1.3.1.2. L’effet de la matrice biologique . 32

2.1.3.1.3. Le type et la structure moléculaire des terpénoïdes . 32

2.1.3.1.4. Le type des microorganismes cibles . 33

2.1.3.2. Le mode d’action antimicrobienne des huiles essentielles 34

2.1.4. Stabilisation des effluents des ruminants par les huiles essentielles . 35

2.1.5. Conclusion . 35

2.2. Biotransformation des terpènes 35

2.2.1. Introduction . 36

2.2.2. Biodégradation d’origine microbienne 36

2.2.2.1. Biotransformation de terpènes en aérobiose . 37

2.2.2.2. Limonène comme molécule modèle . 38

2.2.2.3. Biotransformation en anaérobiose . 40

2.2.2.3.1. Les bactéries dénitrifiantes . 40

2.2.2.3.2. Les bactéries méthanogènes . 43

2.2.2.3.3. Biotransformation des terpènes par la flore microbienne du rumen 43

2

2.2.4. Conclusion . 44

2.3. Les terpènes et la nutrition des ruminants 44

2.3.1. Rappels sur la physiologie du rumen 44

2.3.1.1. Condition de milieu . 45

2.3.1.2. Les microorganismes du rumen 45

2.3.1.3. Le métabolisme digestif des macromolécules dans le rumen . 46

2.3.2. Application des terpènes dans la nutrition et l’alimentation des ruminants

. 47

2.3.2.1. Le rôle des terpènes dans l’ingestion et le comportement alimentaire des

ruminants 47

2.3.2.2. L’impact de terpènes sur le métabolisme du rumen 49

2.3.2.2.1. Les terpènes et leur impact sur les microorganismes du rumen . 50

2.3.2.2.2. Les terpènes et le métabolisme ruminal des glucides 51

2.3.2.2.3. Les terpènes et le métabolisme ruminal des matières azotées 57

2.3.2.2.4. L’effet des terpènes sur métabolisme ruminal des lipides . 59

2.3.3. Application des huiles essentielles en lute contre les parasites intestinaux 59

2.3.4. Conclusion . 61

2.4. Les terpènes dans la traçabilité des produits animaux 61

2.4.1. Introduction . 61

2.4.2. Les prairies et leurs diversités . 62

2.4.3. Les pâturages et les caractéristiques des produits laitiers . 64

2.4.3.1. L’origine des caractéristiques sensorielles des produits laitiers 65

2.4.3.2. L’impact du pâturage sur la caractéristique sensorielle des produits animaux 65

2.4.4. La traçabilité des produits animaux par les terpènes . 66

2.4.5. Les animaux et leurs productions dans la région Méditerranéenne 68

2.4.6. Conclusion . 70

2.5. Conclusion générale 70

2.6. Les questionnements scientifiques et les objectifs expérimentaux 72

3. Partie expérimentale . 75

3.1. Matériels et Méthodes . 76

3.1.1. Expérimentations in vitro 76

3.1.1.1. Les terpènes . 76

3.1.1.2. Maintenance des fermenteurs continus en double effluent . 77

3.1.1.3. Incubation en batch . 78

3.1.1.4. Les analyses chimiques . 79

3.1.2. Expérimentation in vivo 79

3.1.2.1. Les animaux et leur régime . 79

3.1.2.2. Aliments et mode d’alimentation 80

3.1.2.3. Mesures et prélèvements . 80

3.1.2.4. Les analyses réalisées 81

3.2. Aspects méthodologiques (Articles 1 et 2) . 82

3.2.1. Optimisation de la SPME en milieu fermentaire (Article 1) . 82

3.2.1.1. Introduction . 82

3.2.1.2. Matériel et méthodes . 83

3

3.2.1.3. Résultats et discussion . 85

3.2.1.4. Conclusion . 91

3.2.2. Optimisation de la SPME dans le sang (Article 2) 92

3.2.2.1. Introduction . 92

3.2.2.2. Experimental . 94

3.2.2.3. Results . 97

3.2.2.4. Discussion . 103

3.3. Métabolisme de terpènes (In vitro) . 108

3.3.1. Expérimentation 1 (Article 3) 108

3.3.1.1. Introduction . 109

3.3.1.2. Materials and Methods 110

3.3.1.3. Results . 113

3.31.4. Discussion 113

3.3.2. Expérimentation 1 (Article 4) 117

3.3.2.1. Introduction . 117

3.3.2.2. Experimental . 119

3.3.2.3. Results . 123

3.3.2.4. Discussion . 124

3.3.3. Expérimentation 2 (article5) 128

3.3.3.1. Introduction . 128

3.3.3.2. Materials and Methods 129

3.3.3.3. Results . 134

3.3.3.4. Discussion . 137

3.4. Métabolisme de terpènes (in vivo), expérimentation 3 (Article 6) 142

3.4.1. Introduction . 143

3.4.2. Materials and Methods 143

3.4.3. Results . 149

3.4.4. Discussion 151

3.4.5. Conclusion . 157

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