Leforestier, Geraldine (2008) Effects of transgalacto-oligosaccharides on intestinal function : maturation and immune fonction. PhD thesis Nutrition, AgroParistech 2008AGPT0009 p.178.
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Abstract
Non digestible oligosaccharides (NDO) are one of the most studied functional ingredients
because of their potential prebiotic properties. Transgalacto-oligosaccharides (TOS) are shortand
medium-length chains of galactosyl units bound by b1®6 osidic linkages. They are
produced by fermentation of lactose.
The aim of this work, done in collaboration with Blédina, was to evaluate the effects of TOS
consumption on intestinal function. This study was divided into three parts: we have first
evaluated the effects of TOS on intestinal epithelial cells and gut mucosa; then we studied their
effects on intestinal microflora and on parameters of innate and adaptative immunity; the last part
of our work investigated the effects of TOS on biological and clinical symptoms of peanut
allergy.
This work allowed us to establish that TOS consumption induced a wide increase of the total
protein content of the intestinal mucosa. However, this effect was not related to an increase of
mucins production, neither to a trophic effect of TOS. In the second part of this thesis we
confirmed that TOS have a prebiotic effect, as they induced an increase of faecal bifidobacteria.
DGGE analysis showed that TOS also modified lactobacilli diversity, even if they did not affect
their total count. The functions of CD4+ cells in the spleen were also affected by TOS
consumption although this effect was not seeen in Peyer’s patches cells. In our model of peanutsensitized
mice we had shown that TOS diminished biological symptoms of allergy like specific
IgG1 immunoglobulins, but increased splenocytes non specific proliferation and cytokines
release. However we did not observe any diminution of allergic clinical signs.
In summary, our results have proved that TOS consumption were able to induce not only
modifications of the intestinal ecosystem, but also of the peripheral immune system. To better
understand the underlying mechanisms, further investigations would be needed.
| Item Type: | PhD Thesis (PhD) |
|---|---|
| PhD Supervisor: | Tome, Daniel |
| Date: | 14 February 2008 |
| Board of examiners: | Leonil, Joëlle and Boyaka, Prosper N. and Davila-gay, Anne-Marie and Delacroix-buchet, Agnès and Perrin, Emmanuel and Tome, Daniel |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Nutrition |
| Collection (Fonds): | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Subjects: | 7. Life Sciences and Engineering |
| Uncontrolled Keywords: | Transgalacto-oligosaccharides, Prebiotiques, Flore intestinale, Epithelium intestinal, Mucines, Immunite peripherique |
| ID Code: | 4405 |
| Deposited By: | Marina Briffaut |
| Deposited On: | 03 December 2008 |
Table of content
1. PRINCIPAUX OLIGOSACCHARIDES NON-DIGESTIBLES : DEFINITION ET PRESENTATION .16
1.1. Inuline et fructo-oligosaccharides (FOS) 16
1.2. Transgalacto-oligosaccharides 17
1.3. Autres OND 18
1.3.1. Le lactulose 18
1.3.2. Les oligosaccharides issus de l’amidon .19
1.3.3. Les oligosaccharides issus du soja .19
2. EFFETS GASTRO-INTESTINAUX DES OND 20
2.1. Résistance à la digestion 20
2.2. Modulation de la flore : effet prébiotique 21
2.2.1. Définition du concept de « prébiotique » .21
2.2.2. Les FOS et l’inuline .22
2.2.2.1. Etudes in vitro . 22
2.2.2.2. Etudes in vivo 23
2.2.3. Les TOS 24
2.2.3.1. Utilisation par les bactéries intestinales in vitro . 24
2.2.3.2. Effets de l’ingestion de TOS in vivo chez l’animal et l’Homme 25
2.2.4. Effets d’un mélange TOS/FOS en alimentation infantile 26
2.3. Production d’acides gras à chaîne courte (AGCC) .28
2.4. Excrétion fécale et constipation 29
2.5. Physiologie de la muqueuse intestinale .30
2.5.1. Mucines coliques et interactions avec l’écosystème intestinal 30
2.5.2. Effet des OND sur la muqueuse intestinale .31
3. EFFETS IMMUNOMODULATEURS DES PREBIOTIQUES 33
3.1. Le système immunitaire : quelques rappels .33
3.1.1. Immunité innée / immunité acquise .33
3.1.2. Acteurs de l’immunité acquise .33
3.1.2.1. Les lymphocytes B et T 33
3.1.2.2. Les cellules présentatrices d’antigène 35
3.2. Effets des OND sur les cellules du système immunitaire .36
3.2.1. Etudes chez l’animal 36
4
3.2.2. Etudes chez l’Homme 37
3.3. Modulation de réponses immunes spécifiques par les OND 38
3.3.1. Réponse de type vaccinale 38
3.3.2. Réponse de type allergique 39
3.3.2.1. Relation flore fécale-allergie 39
3.3.2.2. OND et prévention de l’allergie 41
3.4. Effet des OND sur le développement du cancer du côlon 43
3.4.1. Mise en évidence d’une relation entre composition de la flore intestinale et
risque de cancer colorectal .43
3.4.2. OND et réduction du risque de cancer colorectal 44
4. EFFETS SYSTEMIQUES DES PREBIOTIQUES 45
4.1. Effets sur le métabolisme lipidique 45
4.2. Effets sur le métabolisme glucidique 47
4.3. Effets sur l’absorption minérale et la minéralisation osseuse .47
4.3.1. Effets des OND sur le métabolisme calcique .47
4.3.1.1. Chez l’animal 47
4.3.1.2. Chez l’Homme 49
4.3.2. Effets sur l’absorption d’autres minéraux 49
MATERIELS & METHODES .51
1. COMPOSITION DE LA FRACTION ENRICHIE EN TOS ET DES REGIMES EXPERIMENTAUX 52
2. EFFET DES TOS SUR L’ACTIVITE DE L’EPITHELIUM INTESTINAL 52
2.1. Etude préliminaire in vitro sur modèle cellulaire Caco-2 .52
2.1.1. Présentation du modèle cellulaire Caco-2 52
2.1.2. Maintien des cellules en culture .53
2.1.3. Protocole d’étude 54
2.1.4. Dosage des protéines totales 54
2.1.5. Mesure des activités enzymatiques 55
2.1.5.1. Activité de la saccharase 55
2.1.5.2. Activité de la phosphatase alcaline 55
2.1.6. Mesure de la prolifération cellulaire 56
2.2. Etudes in vivo chez la souris 56
2.2.1. Activités enzymatiques et caractéristiques morphologiques de l’épithélium
intestinal 56
2.2.1.1. Protocole d’étude 56
2.2.1.2. Traitement des échantillons destinés à l’histologie . 57
2.2.1.3. Dosages enzymatiques 58
2.2.2. Effet des TOS sur la sécrétion de mucus 58
2.2.2.1. Protocole d’étude 58
2.2.2.2. Extraction des ARN . 59
2.2.2.3. Réaction de transcription réverse et PCR quantitative . 59
3. EFFET DES TOS SUR LA FLORE FECALE ET LES PARAMETRES IMMUNITAIRES INTESTINAUX ET
PERIPHERIQUES CHEZ LA SOURIS .60
3.1. Protocole d’étude .60
3.2. Analyse microbiologique des fèces 61
3.3. Dosage des immunoglobulines 61
5
3.3.1. Extraction à partir des fèces 62
3.3.2. Dosage par ELISA .62
3.4. Analyse des paramètres immunitaires par cytométrie en flux .62
3.4.1. Prélèvements des organes et préparation des cellules 62
3.4.2. Détermination du phénotype des lymphocytes 63
3.4.3. Activité de phagocytose .63
3.4.4. Activité cytotoxique des cellules NK .64
4. EFFET DES TOS SUR LA FLORE FECALE ET LES PARAMETRES IMMUNITAIRES DANS LE CADRE
D’UNE SENSIBILISATION A L’ARACHIDE .65
4.1. Protocole d’étude .65
4.1.1. Préparation de l’extrait d’arachide .65
4.1.2. Signes biologiques d’allergie à l’arachide .65
4.1.3. Signes cliniques d’allergie à l’arachide 66
4.2. Analyse des bifidobactéries et lactobacilles dans les fèces 66
4.2.1. Technique de microbiologie classique .66
4.2.2. Technique de DGGE 66
4.2.2.1. Extraction des ADN totaux à partir des fèces et dépôt sur carte FTA®
67
4.2.2.2. Amplification en PCR 67
4.2.2.3. Analyse en DGGE 68
4.2.2.4. Analyse des profils de DGGE 69
4.3. Analyse des splénocytes par cytométrie en flux .70
4.4. Mesure de prolifération des splénocytes 71
4.5. Dosage des cytokines dans les surnageants de culture de splénocytes 71
4.6. Dosage des anticorps spécifiques anti-arachide 72
4.7. Test de provocation et évaluation des signes cliniques d’allergie à l’arachide 72
5. ANALYSE STATISTIQUE .73
RESULTATS .74
1. EFFET DES TOS SUR L’ACTIVITE DE L’EPITHELIUM INTESTINAL 75
1.1. Etude préliminaire in vitro .75
1.1.1. Prolifération cellulaire 75
1.1.2. Activités enzymatiques 76
1.2. Etude in vivo .76
1.2.1. Taille des villosités intestinales 77
1.2.2. Activités enzymatiques et contenu en ADN de la membrane de bordure en
brosse 77
1.2.3. Contenu protéique de la muqueuse intestinale .78
1.2.4. Expression des gènes codant pour MUC-2, MUC-3, MUC-4 et TNF-α .79
2. EFFET DES TOS SUR LA FLORE INTESTINALE ET LES PARAMETRES IMMUNITAIRES
INTESTINAUX ET PERIPHERIQUES CHEZ LA SOURIS .81
2.1. Flore fécale 81
2.1.1. Lactobacilles .81
2.1.2. Bifidobactéries .82
2.2. Phénotype des lymphocytes 83
2.2.1. Dans la rate .83
2.2.2. Dans les plaques de Peyer 84
6
2.3. Activité de phagocytose 85
2.4. Activité des cellules NK 86
2.5. Immunoglobulines totales 87
2.5.1. Dans le sérum .87
2.5.2. Dans les fèces .88
3. EFFETS DES TOS SUR LA FLORE FECALE ET LES PARAMETRES IMMUNITAIRES DANS LE
CADRE D’UNE SENSIBILISATION A L’ARACHIDE .90
3.1. Etude des signes biologiques d’allergie à l’arachide 90
3.1.1. Phénotype des splénocytes 90
3.1.2. Prolifération des splénocytes 91
3.1.3. Production de cytokines .92
3.1.4. Production d’anticorps spécifiques anti-arachide 94
3.2. Etudes des signes cliniques d’allergie à l’arachide .94
3.2.1. Evolution de la flore fécale 94
3.2.1.1. Analyse quantitative par dénombrement sur milieux sélectifs 94
3.2.1.2. Analyse de la flore lactobacille par DGGE . 96
3.2.2. Production d’anticorps spécifiques anti-arachide 97
3.2.3. Signes cliniques d’allergie 97
DISCUSSION .99
LES TOS MODIFIENT LE PROFIL DE LA FLORE FECALE .100
LES TOS MODULENT CERTAINES ACTIVITES DE L’EPITHELIUM INTESTINAL 105
LES TOS SONT CAPABLES DE MODIFIER LES PARAMETRES IMMUNITAIRES PERIPHERIQUES .110
LES TOS MODULENT LES REPONSES BIOLOGIQUES A UNE SENSIBILISATION A L’ARACHIDE MAIS
N’ONT PAS D’EFFET SUR LES SIGNES CLINIQUES .114
Modèle de souris BALB/c .115
Modèle de souris C3H 117
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