Streit, Fernanda (2008) Influence of harvesting and concentration conditions on the physiological state and cryotolerance of lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cfl1. PhD thesis GENIE MICROBIOLOGIQUE, Unité Mixte de Recherche Génie et Microbiologie des Procédés Alimentaires, AgroParistech 2008AGPT0040 p.223.

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Abstract

This study aimed at quantifying the effect of harvesting and concentration steps on Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 cryotolerance. It intended to analyse the physiological mechanisms that explained the different levels of cryotolerance. Another goal of this work consisted to submit the cells to a moderate stress, thus allowing them to adapt themselves to better resist the stress during the freezing step.

During the first part of this work, the effect of an acidification, at the end of the fermentation, was studied on cellular cryotolerance. An experimental design made it possible to identify the optimal acidification condition (pH 5.25 for 30 min) that permitted adaptation of the cells. This condition provided highly resistant cells to freezing and frozen storage at -20 °C. Two physiological mechanisms were found to explain this adaptation. The first one corresponded to the increase of the membrane fatty acid C18:1 content, and then to membrane fluidity. From proteome analysis, the second one was characterized by a reduction in protein metabolism, an increase in energetic and nucleotide metabolism and a higher synthesis of stress proteins.

In the second part of this study, cells were concentrated according to different centrifugation conditions (speed, duration and temperature). These conditions did not affect the resistance of Lb. bulgaricus CFL1 to the concentration process itself. However, they had a small but significant effect on their cryotolerance. As the behaviour of cells resistance during freezing and frozen storage was opposite, the effect of centrifugation conditions on their activity after long time storage was not significant.

The last part of this work made it possible to analyse the effects of microfiltration conditions on Lb. bulgaricus CFL1 resistance to concentration, freezing and frozen storage and on its physiological responses. Results show that cells were less resistant to microfiltration than centrifugation. In contrast, their resistance to freezing was significantly improved (in a range of 28% to 88%), according to the microfiltration conditions applied, as compared to the centrifuged cells. The higher cryotolerance was obtained with a cross flow velocity of 2.01 m.s-1 and a transmembrane pressure of 0.15 MPa. This improved resistance was related to an increase of C16:0, C18:1 and cycC19:0 membrane fatty acid concentrations and a reduction of the C14:0 content. Results obtained from proteome analysis displayed that cells exhibiting high activity and resistance were characterized by an increase in their energetic metabolism and, in contrast, by a reduction in their general and protein metabolisms.

Finally, during this thesis, two interesting approaches were performed with the aim to adapt Lb. bulgaricus CFL1 for a better cryotolerance. Some general physiological responses, responsible for the cellular adaptation, were identified at membrane and cytosolic levels.

Table of content

LISTE DES PUBLICATIONS - 6

LISTE DES ABREVIATIONS - 7

INTRODUCTION GENERALE - 10

CHAPITRE I - SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE - 13

I.1 Applications des bactéries lactiques et probiotiques - 13

I.1.1 Définitions - 13

I.1.2 Applications - 13

I.1.3 Propriétés fonctionnelles et technologiques recherchées - 14

I.2 Production de ferments lactiques - 15

I.2.1 Evolution des techniques d’ensemencement - 15

I.2.2 Avantages de l’utilisation des ferments concentrés - 16

I.2.3 Formes commerciales des ferments lactiques - 16

I.2.4 Procédé de production des ferments lactiques concentrés - 17

I.2.4.1 Préparation et prétraitement des milieux de culture - 17

I.2.4.2 Préparation de l’inoculum - 18

I.2.4.3 Fermentation - 18

I.2.4.4 Refroidissement et récolte des ferments - 19

I.2.4.5 Concentration des cellules - 20

I.2.4.6 Cryoprotection - 20

I.2.4.7 Congélation ou lyophilisation - 21

I.2.4.8 Conditionnement et mélange - 22

I.2.4.9 Stockage, distribution et utilisation - 22

I.3 Qualité technologique des ferments lactiques concentrés - 23

I.3.1 Méthodes d’évaluation de la qualité technologique des ferments lactiques concentrés 23

I.3.1.1 Viabilité - 23

I.3.1.2 Activité acidifiante - 23

I.3.1.3 Autres propriétés technologiques et activités métaboliques - 28

I.3.2 Facteurs influençant la qualité des bactéries lactiques concentrées congelées - 32

I.3.2.1 Type de microorganisme - 32

I.3.2.2 Milieu de culture - 33

I.3.2.3 Conditions de culture - 33

I.3.2.4 Age de la culture - 35

I.3.2.5 Refroidissement des cellules - 35

I.3.2.6 Concentration - 36

I.3.2.7 Cryoprotection - 38

I.3.2.8 Influence de la congélation - 39

I.3.2.9 Stockage - 42

I.3.3 Conclusion - 42

I.4 Réponses physiologiques des cellules aux stress - 43

I.4.1 Etude des changements au niveau de la membrane cellulaire - 45

I.4.1.1 Fonctions et structure de la membrane - 45

I.4.1.2 Modifications de la structure membranaire - 46

I.4.1.3 Méthodes pour caractériser la membrane cellulaire - 48

I.4.2 Changements au niveau du métabolisme cellulaire - 49

I.4.2.1 Transcriptomique - 51

I.4.2.2 Protéomique - 52

I.4.2.3 Métabolomique - 53

I.4.3 Facteurs influençant l’état physiologique des bactéries lactiques - 55

I.4.3.1 Effet des conditions environnementales sur la composition en acides gras

membranaires des bactéries lactiques et conséquences sur leurs fonctionnalités - 55

I.4.3.2 Effet des conditions environnementales sur le protéome des bactéries lactiques et

conséquences sur leurs fonctionnalités - 63

I.5 Conclusion générale - 72

CHAPITRE II - MATERIEL ET METHODES - 73

II.1 Production de ferments lactiques concentrés - 73

II.1.1 Microorganisme utilisé - 73

II.1.2 Milieu de culture - 73

II.1.3 Fermentation - 73

II.1.3.1 Equipements et conditions de culture - 73

II.1.3.2 Suivi et contrôle des fermentations - 74

II.1.3.3 Arrêt des fermentations - 76

II.1.3.4 Refroidissement et récolte - 76

II.1.4 Concentration des suspensions bactériennes - 76

II.1.4.1 Concentration par centrifugation - 76

II.1.4.2 Concentration par microfiltration - 77

II.1.5 Stabilisation - 77

II.1.6 Techniques analytiques - 77

II.1.6.1 Détermination de la concentration bactérienne - 77

II.1.6.2 Analyse des constituants du milieu - 78

II.2 Mesure de l’activité acidifiante - 78

II.2.1 Système expérimental - 78

II.2.2 Protocole de mesure - 80

II.2.3 Mesure de l’activité acidifiante spécifique - 80

II.2.3.1 Définition - 80

II.2.3.2 Perte d’activité acidifiante spécifique au cours de l’étape de concentration - 80

II.2.3.3 Perte de l’activité acidifiante spécifique au cours de la congélation - 81

II.2.3.4 Perte de l’activité acidifiante spécifique au cours du stockage à -20 °C - 81

II.3 Microfiltration tangentielle - 83

II.3.1 Description du système de microfiltration - 83

II.3.1.1 Module - 83

II.3.1.2 Mesure du flux de perméat - 85

II.3.2 Calcul des paramètres caractéristiques de la microfiltration - 85

II.3.3 Caractérisation du module de microfiltration - 86

II.3.3.1 Détermination de la résistance hydraulique - 86

II.3.3.2 Etalonnage de la pompe - 87

II.3.3.3 Relations entre les paramètres réglables du module et les variables

caractéristiques de la microfiltration - 88

II.3.4 Nettoyage et décontamination du système de microfiltration - 90

II.3.4.1 Nettoyage - 90

II.3.4.2 Décontamination - 91

II.4 Analyse de la composition en acides gras membranaires - 91

II.4.1 Lavage des cellules - 92

II.4.2 Méthylation et extraction - 92

II.4.3 Analyse des acides gras méthylés par chromatographie en phase gazeuse - 92

II.4.4 Identification des composés - 93

II.4.5 Quantification des teneurs relatives en acides gras membranaires - 94

II.5 Analyse protéomique - 94

II.5.1 Principe - 94

II.5.2 Extraction et purification des protéines - 95

II.5.2.1 Lavage et lyse des cellules - 95

II.5.2.2 Dosage des protéines - 95

II.5.2.3 Purification de l’échantillon - 95

II.5.3 Première dimension de l’électrophorèse bidimensionnelle - 96

II.5.3.1 Focalisation isoélectrique - 96

II.5.3.2 Equilibration - 97

II.5.4 Deuxième dimension de l’électrophorèse bidimensionnelle - 97

II.5.4.1 Nettoyage et montage des plaques de gel - 97

II.5.4.2 Préparation d’un gel d’acrylamide - 97

II.5.4.3 Migration - 98

II.5.5 Coloration des gels - 98

II.5.6 Acquisition et analyse d’images - 98

II.5.6.1 Numérisation des images - 98

II.5.6.2 Analyse d’images - 98

II.5.6.3 Comparaison des gels obtenus dans des conditions différentes - 99

II.5.7 Identification des protéines par spectrométrie de masse MALDI-TOF - 100

II.5.7.1 Principe - 100

II.5.7.2 Protocole expérimental - 101

II.5.7.3 Traitements des résultats - 101

II.6 Plans d’expériences - 101

II.6.1 Plan d’expériences de type CCRD - 102

II.6.2 Effet d’une acidification en fin de fermentation - 104

II.6.2.1 Influence du pH sur la croissance de Lb. bulgaricus CFL1 - 104

II.6.2.2 Description du plan d’expériences n°1 - 105

II.6.2.3 Effet du type d’acide utilisé pour l’acidification - 106

II.6.2.4 Effet d’une remontée du pH à 6 après acidification - 107

II.6.3 Effet des conditions de centrifugation - 107

II.6.3.1 Description du plan d’expériences n°2 - 107

II.6.3.2 Effet de la température de centrifugation - 108

II.6.4 Effet des conditions de microfiltration tangentielle - 108

II.6.4.1 Description du plan d’expériences n°3 - 109

II.6.4.2 Comparaison entre microfiltration tangentielle et centrifugation - 110

II.7 Traitements statistiques - 110

II.7.1 Régressions linéaires - 110

II.7.2 Régressions linéaires multivariables - 110

II.7.3 Analyses de variance (ANOVA) - 111

II.7.4 Analyses en composantes principales (ACP) - 111

CHAPITRE III - RESULTATS ET DISCUSSION - 113

III.1 Influence d’une acidification en fin de fermentation sur la cryotolérance de Lb.

bulgaricus CFL1 - 113

III.1.1 Contexte et objectifs - 113

III.1.2 Publication 1. L’acidification améliore la cryotolérance de Lactobacillus delbrueckii

subsp. bulgaricus CFL1 - 114

III.1.3 Conclusion - 124

III.2 Influence d’une acidification en fin de fermentation sur les réponses physiologiques

au niveau de la membrane et du protéome, liées à une meilleure cryotolérance de Lb.

bulgaricus CFL1 - 125

III.2.1 Contexte et objectifs - 125

III.2.2 Publication 2. L’adaptation acide de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus induit

des réponses physiologiques, au niveau de la membrane et du cytoplasme, responsables

d’une meilleure cryotolérance - 126

III.2.3 Conclusion - 147

III.3 Influence des conditions de concentration par centrifugation sur la cryotolérance de

Lb. bulgaricus CFL1 - 148

III.3.1 Contexte et objectifs - 148

III.3.2 Publication 3. Effet des conditions de centrifugation sur la cryotolérance de

Lactobacillus bulgaricus CFL1 - 149

III.3.3 Conclusion - 163

III.4 Effet des conditions de microfiltration tangentielle sur l’état physiologique et les

propriétés technologiques de Lb. bulgaricus CFL1 - 164

III.4.1 Contexte et objectifs - 164

III.4.2 Publication 4. Les conditions de microfiltration induisent des changements de la

cryotolérance de Lb. bulgaricus, correspondant à des réponses physiologiques différentes des

cellules - 165

III.4.3 Analyse des changements du protéome de Lb. bulgaricus CFL1 en fonction des

conditions de microfiltration - 186

III.4.4 Conclusion - 191

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES - 193

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 199

ANNEXES……… - 215

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