Cosse, Audrey (2007) Transcriptome analysis during defense response in the brown alga Laminaria digitata. PhD thesis BIOLOGIE, UMR 7139, Station biologique de Roscoff (CNRS/UPMC), AgroParistech 2007AGPT0053 p.248.

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Abstract

Host-pathogen interactions in terrestrial plants are well described at the physiological, metabolic or

molecular levels. However, defense induction and regulation have hardly been studied in marine

macroalgae. In the brown alga Laminaria digitata, studies have shown that oligoguluronates elicit

defense responses. Significant progress has been made in understanding the signalling events which

produce an oxidative burst and confer late resistance. The halogenated metabolism is particularly

active in this species. It seems to be involved in defense responses as indicated by the emission of

molecular iodine and volatile halogenated organic compounds after elicitation. In this context, this

thesis investigated the transcriptome regulation in response to the perception of oligoluronates by

substractive suppressive hybridization, macroarray and real time PCR. Differential expression was

confirmed for ten genes encoding haloperoxidases, thioredoxins and pentose phosphate pathway

enzymes. Theses results suggest that L. digitata has developed an original strategy to cope with

oxidative stress. The importance of halogenated metabolism in defense responses was highlighted by

differential expression of haloperoxidase members. The specific regulation of a few members of this

multigenic family represents the first report confirming that some haloperoxidase members have

evolved toward specialized functions. Identification of these defense molecular markers led to the first

identification of the intracellular pathway involving defense genes activation in L. digitata. Hydrogen

peroxide was found to be a key actor in different pathways of this signaling cascade. The tools

developed and the molecular markers identified in this study should make possible to extend the

understanding of defense responses in macroalgae in the context of biotic interactions and longdistance

signaling.

Table of content

Introduction bibliographique. 19

I. Abrégé des concepts de phytopathologie et des réponses de défense des plantes. 20

I.A Les différents types d’interaction et de résistance . 20

I.B La reconnaissance du pathogène 21

I.C Transduction du signal et activation des réponses de défense . 22

I.D La régulation incontournable du transcriptome . 24

II. Interaction hôte-pathogène chez les algues marines . 25

II.A Pathologie des algues marines . 26

II.B Reconnaissance de l’agent pathogène 27

II.C Réponses de défense 31

III. Le métabolisme halogéné, un métabolisme de défense chez les algues marines ? 49

III.A Métabolisme halogéné et haloperoxydases 49

III.B Un rôle dans la protection cellulaire 55

III.C Un arsenal varié de la défense chimique 56

IV. Avancées transcriptomiques et génomiques chez les algues marines 63

IV.A Ascension des données génomiques et transcriptomes chez les algues. 63

IV.B Des banques EST comme stratégie initiale pour rechercher des gènes de défense

putatifs… . 67

IV.C Développement d’outil d’expression différentielle chez les macroalgues : Identification de

gènes de défense . 74

Contexte & Problématique 77

I. Modèle d'étude : Laminaria digitata . 77

I.A Position phylogénétique. 77

I.B Cycle biologique 78

I.C Valorisation de la ressource algale de L. digitata 81

II. Vers une meilleure compréhension du transcriptome de la défense chez L. digitata. 81

II.A Les acquis sur les réponses de défense de L. digitata 82

II.B Un métabolisme halogéné actif, impliqué dans la défense ? . 84

II.C Les données transcriptomiques disponibles chez L. digitata. 85

II.D La problématique et les objectifs . 85

Matériels & Methodes. 89

I. Matériel végétal et traitement . 89

I.A Matériel végétal . 89

I.B Elicitation par les oligoguluronates . 90

I.C Dosage du peroxyde d’hydrogène par chimioluminescence. 92

II. Analyse de biologie moléculaire 92

II.A Extraction des acides nucléiques . 92

II.B Séquençage et analyse des séquences 94

II.C Analyses transcriptionnelles 95

Résultats & Discussion 105

Chapitre I. Vers la construction en interne d'un filtre dédié stress .105

I. Hybridation des macroarrays 106

I.A Mise au point d'un protocole d'hybridation 106

I.B Expression différentielle : artefact ou réalité ? 106

II. Création d'un filtre orienté stress . 108

II.A Analyse de la banque soustractive . 109

II.B Finalisation du filtre. 111

II.C Réflexions sur la qualité des filtres générés. 115

Chapitre II. Macroarray : un outil de profilage d'expression génique des

réponses de défense .118

I. Une stratégie payante pour l’identification de gènes de défense . 118

I.A Régulation transcriptionnelle de la réponse aux oligoguluronates mise en évidence par

macroarray 118

I.B Une régulation rapide et séquentielle du transcriptome : réponses précoces et

tardives ? 124

II. La banque soustractive, un premier pas vers la caractérisation du transcriptome de

la défense . 125

II.A Expression des EST issues de la banque soustractive analysée par macroarray. 126

II.B Intérêt et validation de la banque soustractive. 127

III. Identification par macroarray de voie de signalisation et d’activation de voie

métabolique suite à l’élicitation 128

III.A La S-adénosyl méthionine synthétase 129

III.B Les glutathion-S-transférases. 130

III.C Les ABC transporteurs. 131

III.D Les Heat shock Protéines. 131

III.E Les pigments photosynthétiques 132

III.F La répression des gènes du métabolisme basal ? . 132

Chapitre III. Identification de marqueurs moléculaires des réponses de

défense……….135

I. Validation de l’approche macroarray par PCR Quantitative 136

I.A Comparaison des résultats d’expression obtenue par macroarray et PCR Quantitative . 136

I.B Biais intrinsèque aux deux méthodes. 138

I.C Biais liés au matériel biologique 139

II. Algues cultivées versus algues sauvages : Phénomène de potentialisation . 140

II.A Comparaison du burst oxydant et des réponses transcriptionnelles 141

II.B Phénomène de potentialisation 145

III. Ce qu’indique la régulation des gènes sur les voies métaboliques impliquées dans les

réponses de défense 148

III.A Le métabolisme halogéné : originalité et particularité des algues marines 151

III.B La voie des pentoses phosphates : un rôle central dans la régulation redox cellulaire 155

III.C La mannitol-1-phosphate deshydrogénase : un nouveau gène de défense ? 160

III.D Les thiorédoxines : des enzymes à activité anti-oxydante . 164

IV. Régulation transcriptionnelle liée au burst oxydant 172

IV.A Dissection de la signalisation du burst oxydant par une approche pharmacologique 172

IV.B Mise en évidence de trois voies de signalisation conduisant à l’activation de la

transcription . 174

IV.C Une voie de signalisation déterminée en fonction du type de gènes considéré ? 178

Conclusions & Perspectives 181

I. Approches transcriptomiques des défenses chez les macroalgues. 183

II. La gestion du stress oxydant chez L. digitata . 184

II.A Une gestion du stress oxydant originale 184

II.B Perspectives . 186

III. Originalité d’un métabolisme halogéné actif impliqué dans les réponses de

défense… . 188

III.A v-BPO3 et v-IPO3, mise en évidence du lien entre métabolisme de défense et métabolisme

halogéné. 188

III.B Perspectives . 189

IV. Immunité innée. 191

IV.A Conservation des mécanismes de défense et communication à distance. 191

IV.B Perspectives . 193

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