Cosse, Audrey (2007) Analyse du transcriptome des réponses de défense de l'algue brune Laminaria digitata. Doctorat BIOLOGIE, UMR 7139, Station biologique de Roscoff (CNRS/UPMC), AgroParistech 2007AGPT0053 p.248.

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Résumé

Alors que la base des interactions hôte-pathogène chez les plantes terrestres sont désormais très bien décrites, que ce soit au niveau physiologique, métabolique ou moléculaire, chez les macroalgues marines les investigations n’en sont qu’à leur début. Chez l’algue brune L. digitata, les études sur les réponses de défense suite à l'élicitation par les oligoguluronates, ont permis d'appréhender la transduction du signal conduisant à la production d'un burst oxydant, ainsi que la mise en place tardive de la résistance. Le métabolisme halogéné est particulièrement actif chez cette algue. Il semble être impliqué dans les réponses de défense comme en témoigne l’émission d’iode moléculaire et de composés organiques halogénés volatils, suite à l’élicitation par les oligoguluronates. Dans ce contexte, j’ai étudié la régulation du transcriptome de L. digitata en réponse à l’élicitation par les oligoguluronates, par hybridation soustractive suppressive, macroarray et PCR Quantitative. J’ai ainsi identifié dix gènes codant notamment des haloperoxydases, des thiorédoxines et des enzymes de la voie des pentoses phosphates. L’induction de ces gènes suite à l’élicitation suggère une gestion originale du stress oxydant chez L. digitata. L’implication du métabolisme halogéné dans les réponses de défense a été mise en avant par l’expression différentielle de certains gènes codant des haloperoxydases. La régulation spécifique de certains de ces gènes apporte la première preuve expérimentale que les différents membres d’haloperoxydases ont évolué vers des fonctions biologiques spécifiques. L’identification de ces gènes comme marqueurs moléculaires des réponses de défense a permis d’établir la première modélisation de la signalisation intracellulaire conduisant à l’activation de gènes de défense de L. digitata et de souligner le rôle du peroxyde d’hydrogène dans plusieurs voies distinctes. Les outils développés et les marqueurs moléculaires identifiés permettront d'approfondir la compréhension des réponses de défense des macroalgues dans le contexte des interactions biotiques et de la signalisation à distance.

Table des Matières

Introduction bibliographique. 19

I. Abrégé des concepts de phytopathologie et des réponses de défense des plantes. 20

I.A Les différents types d’interaction et de résistance . 20

I.B La reconnaissance du pathogène 21

I.C Transduction du signal et activation des réponses de défense . 22

I.D La régulation incontournable du transcriptome . 24

II. Interaction hôte-pathogène chez les algues marines . 25

II.A Pathologie des algues marines . 26

II.B Reconnaissance de l’agent pathogène 27

II.C Réponses de défense 31

III. Le métabolisme halogéné, un métabolisme de défense chez les algues marines ? 49

III.A Métabolisme halogéné et haloperoxydases 49

III.B Un rôle dans la protection cellulaire 55

III.C Un arsenal varié de la défense chimique 56

IV. Avancées transcriptomiques et génomiques chez les algues marines 63

IV.A Ascension des données génomiques et transcriptomes chez les algues. 63

IV.B Des banques EST comme stratégie initiale pour rechercher des gènes de défense

putatifs… . 67

IV.C Développement d’outil d’expression différentielle chez les macroalgues : Identification de

gènes de défense . 74

Contexte & Problématique 77

I. Modèle d'étude : Laminaria digitata . 77

I.A Position phylogénétique. 77

I.B Cycle biologique 78

I.C Valorisation de la ressource algale de L. digitata 81

II. Vers une meilleure compréhension du transcriptome de la défense chez L. digitata. 81

II.A Les acquis sur les réponses de défense de L. digitata 82

II.B Un métabolisme halogéné actif, impliqué dans la défense ? . 84

II.C Les données transcriptomiques disponibles chez L. digitata. 85

II.D La problématique et les objectifs . 85

Matériels & Methodes. 89

I. Matériel végétal et traitement . 89

I.A Matériel végétal . 89

I.B Elicitation par les oligoguluronates . 90

I.C Dosage du peroxyde d’hydrogène par chimioluminescence. 92

II. Analyse de biologie moléculaire 92

II.A Extraction des acides nucléiques . 92

II.B Séquençage et analyse des séquences 94

II.C Analyses transcriptionnelles 95

Résultats & Discussion 105

Chapitre I. Vers la construction en interne d'un filtre dédié stress .105

I. Hybridation des macroarrays 106

I.A Mise au point d'un protocole d'hybridation 106

I.B Expression différentielle : artefact ou réalité ? 106

II. Création d'un filtre orienté stress . 108

II.A Analyse de la banque soustractive . 109

II.B Finalisation du filtre. 111

II.C Réflexions sur la qualité des filtres générés. 115

Chapitre II. Macroarray : un outil de profilage d'expression génique des

réponses de défense .118

I. Une stratégie payante pour l’identification de gènes de défense . 118

I.A Régulation transcriptionnelle de la réponse aux oligoguluronates mise en évidence par

macroarray 118

I.B Une régulation rapide et séquentielle du transcriptome : réponses précoces et

tardives ? 124

II. La banque soustractive, un premier pas vers la caractérisation du transcriptome de

la défense . 125

II.A Expression des EST issues de la banque soustractive analysée par macroarray. 126

II.B Intérêt et validation de la banque soustractive. 127

III. Identification par macroarray de voie de signalisation et d’activation de voie

métabolique suite à l’élicitation 128

III.A La S-adénosyl méthionine synthétase 129

III.B Les glutathion-S-transférases. 130

III.C Les ABC transporteurs. 131

III.D Les Heat shock Protéines. 131

III.E Les pigments photosynthétiques 132

III.F La répression des gènes du métabolisme basal ? . 132

Chapitre III. Identification de marqueurs moléculaires des réponses de

défense……….135

I. Validation de l’approche macroarray par PCR Quantitative 136

I.A Comparaison des résultats d’expression obtenue par macroarray et PCR Quantitative . 136

I.B Biais intrinsèque aux deux méthodes. 138

I.C Biais liés au matériel biologique 139

II. Algues cultivées versus algues sauvages : Phénomène de potentialisation . 140

II.A Comparaison du burst oxydant et des réponses transcriptionnelles 141

II.B Phénomène de potentialisation 145

III. Ce qu’indique la régulation des gènes sur les voies métaboliques impliquées dans les

réponses de défense 148

III.A Le métabolisme halogéné : originalité et particularité des algues marines 151

III.B La voie des pentoses phosphates : un rôle central dans la régulation redox cellulaire 155

III.C La mannitol-1-phosphate deshydrogénase : un nouveau gène de défense ? 160

III.D Les thiorédoxines : des enzymes à activité anti-oxydante . 164

IV. Régulation transcriptionnelle liée au burst oxydant 172

IV.A Dissection de la signalisation du burst oxydant par une approche pharmacologique 172

IV.B Mise en évidence de trois voies de signalisation conduisant à l’activation de la

transcription . 174

IV.C Une voie de signalisation déterminée en fonction du type de gènes considéré ? 178

Conclusions & Perspectives 181

I. Approches transcriptomiques des défenses chez les macroalgues. 183

II. La gestion du stress oxydant chez L. digitata . 184

II.A Une gestion du stress oxydant originale 184

II.B Perspectives . 186

III. Originalité d’un métabolisme halogéné actif impliqué dans les réponses de

défense… . 188

III.A v-BPO3 et v-IPO3, mise en évidence du lien entre métabolisme de défense et métabolisme

halogéné. 188

III.B Perspectives . 189

IV. Immunité innée. 191

IV.A Conservation des mécanismes de défense et communication à distance. 191

IV.B Perspectives . 193

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