Garrido, Edith (2007) Effect of cytotoxic agents on ABC transpoters expression. PhD thesis ICSN, ICSN, EP/X p.232.

Alternative Locations: http://www.imprimerie.polytechnique.fr/Theses/Files/Garrido.pdf

Abstract

The human ATP-binding cassette (ABC) transporters comprise a large family of membrane transport proteins. Many ABC genes play a role in human genetic disease, and several induce resistance phenotypes.
This paper presents the expression pattern of the complete human ABC superfamily by real-time RT-PCR in various organs, or in response to treatment in humans and mice.
We studied the effect of colchicine exposure on human cell lines and mice. We have shown that this treatment induce ABC transporters expression.
We have established the first mapping of ABC transporters during development liver. Some transporters absent in the fetal liver and speak after birth, probably play a role in the adult liver. By contrast the expression of some transporters extinguished after birth, suggesting a role in hematopoiesis.
We measured the expression of ABC transporters in patients with acute leukemias correlated with their sensitivity to chemotherapy. In an interesting way, we have shown that transporeters not described in the resistance could contribute to a poor prognosis.
Finally, we studied the ABC transcritpome in human stem cells at different stages of differentiation. Some differences of expression may characterize a state of differentiation and to be involved in self-renewal or differentiation of stem cells.

Table of content

TABLE DES MATIERES - 7
LISTE DES ABREVIATIONS - 13
CHAPITRE I INTRODUCTION GENERALE - 17
I LA FAMILLE DES TRANSPORTEURS ABC - 17
II ORGANISATION DES TRANSPORTEURS ABC - 19
III TRANSPORTEURS ABC : FONCTIONS ET MALADIES ASSOCIEES - 20
IV CONTEXTE BIOLOGIQUE ET PROBLEMATIQUE - 28
VBIBLIOGRAPHIE - 30
CHAPITRE II LA PCR QUANTITATIVE - 35
I PRINCIPE DE PCR - 35
1 HISTORIQUE - 36
2 UNE APPLICATION : LA PCR QUANTITATIVE - 37
2.1 Le SYBR Green - 39
2.2 La chimie Taqman - 39
II METHODES UTILISEES AU LABORATOIRE - 40
1 PCR SYBR GREEN - 40
1.1 Description de la technique - 40
1.2 Gamme de dilution et efficacité de la réaction - 41
1.3 Dessin des amorces - 43
1.4 Spécificité des amorces - 43
1.5 Inconvénients de la technique SYBR Green-I - 44
2 PUCE A OLIGONUCLEOTIDES - 44
2.1 Elaboration de la puce : critères de choix d’une sonde - 45
2.2 Description de notre puce à oligonucléotides - 45
2.3 Exemple de résultats obtenus sur la puce à oligonucléotides - 46
2.4 Inconvénients de la technique de puce à oligonucléotides - 47
3 PCR QUANTITATIVE TAQMAN - 47
3.1 Sondes TaqMan MGB - 48
3.2 Cartes microfluidiques ou TLDA - 48
3.3 Vérification de chaque courbe d’amplification et détermination du seuil - 48
3.4 Reproductibilité de la PCR utilisant les sondes ABC transporteurs - 49
3.5 Recherche des meilleurs gènes de référence pour la normalisation - 50
3.6 Calcul de la quantification relative - 54
3.7 Calcul de l’efficacité - 54
III BIBLIOGRAPHIE - 60
8
CHAPITRE III EFFET DE LA COLCHICINE SUR L’EXPRESSION DES
TRANSPORTEURS ABC - 65
I INTRODUCTION - 65
1 LA COLCHICINE - 65
2 LA MUCOVISCIDOSE - 65
2.1 Historique - 65
2.2 Epidémiologie, Diagnostic et Symptômes - 66
2.3 Pronostic - 67
2.4 Implication du canal CFTR/ABCC7 - 68
2.5 Stratégies de correction des phénotypes CF - 69
3 INTERET DE LA COLCHICINE POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE - 69
II MODELES D’ETUDE - 70
III RESULTATS - 71
1 RESULTATS IN VITRO : TRAITEMENT DE CELLULES HL60 ET K562 PAR LA COLCHICINE - 71
1.1 Traitements effectués - 71
1.2 Choix des meilleurs gènes de référence - 71
1.3 Incidence du traitement sur l’expression des transporteurs ABC - 72
2 RESULTATS IN VIVO : TRAITEMENT DE SOURIS C57BL6 PAR LA COLCHICINE - 75
2.1 Traitements effectués - 75
2.2 Gènes d’intérêt testés - 75
2.3 Choix des meilleurs gènes de référence - 75
2.4 Comparaison de l’expression des transporteurs ABC dans les organes non traités de souris - 77
2.5 Variations d’expression induites par le traitement de souris par la colchicine - 81
2.6 Dans l’intestin - 84
IV DISCUSSION - 86
V BIBLIOGRAPHIE - 91
CHAPITRE IV LES TRANSPORTEURS ABC AU COURS DU DEVELOPPEMENT
HEPATIQUE - 97
I INTRODUCTION - 97
1 LE FOIE FOETAL - 97
1.1 Le développement du foie - 97
1.2 Elimination de xénobiotiques par le foie foetal - 98
2 FONCTIONS DU FOIE ADULTE - 98
2.1 Métabolique - 98
2.2 Production de la bile - 99
2.3 Détoxication - 99
3 IMPORTANCE DES TRANSPORTEURS ABC DANS LE FOIE - 100
II RESULTATS - 101
4 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 102
5 PROFILS D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC - 103
III DISCUSSION - 112
III ANNEXE 1 - 116
IV ANNEXE 2 - 122
IV BIBLIOGRAPHIE - 123
9
CHAPITRE V : EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS DES
CELLULES SOUCHES HUMAINES - 129
I INTRODUCTION - 129
1 LES DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES - 129
2 CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES - 131
2.1 Historique - 131
2.2 Loi Française - 131
2.3 Obtention de cellules souches embryonnaires - 131
2.4 Différenciation de cellules souches embryonnaires - 132
2.5 Des résultats encourageants chez l’animal… - 132
3 LES CELLULES SOUCHES ADULTES - 132
4 LES CELLULES SOUCHES : DE LA RECHERCHE FONDAMENTALE A LA RECHERCHE CLINIQUE - 133
5 LES TRANSPORTEURS ABC DANS LES CELLULES SOUCHES - 133
II RESULTATS - 136
1 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 136
2 PROFILS D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC - 138
3 QUANTIFICATION RELATIVE - 142
IV DISCUSSION - 143
V ANNEXE - 147
VII BIBLIOGRAPHIE - 154
CHAPITRE VI : LES TRANSPORTEURS ABC ET LA CHIMIORESISTANCE DANS
LES LEUCEMIES AIGUES MYELOBLASTIQUES - 161
I INTRODUCTION - 161
1 GENERALITES - 161
2 ETIOLOGIE - 161
2.1 Facteurs génétiques - 162
2.2 Facteurs environnementaux - 162
3 SYMPTOMES ET DIAGNOSTIC - 163
3.1 Etats pré-cliniques - 163
3.2 Signes cliniques - 163
3.3 Diagnostic hématologique - 163
3.4 Facteurs de pronostic - 164
4 TRAITEMENTS - 165
5 LEUCEMIES ET ROLE DES TRANSPORTEURS ABC DANS LES MECANISMES DE MULTIRESISTANCE AUX
CHIMIOTHERAPIES - 167
II METHODES - 169
1 PATIENTS LAM TESTES ET DEFINITION DE GROUPES - 169
2 OUTILS, METHODES ET NORMALISATION DES EXPERIENCES DE QPCR - 171
2.1 Transporteurs ABC étudiés - 171
2.2 Choix des gènes de référence - 171
III RESULTATS - 175
1 PROFIL D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS LES LAM - 175
2 QUANTIFICATION RELATIVE DE CHAQUE TRANSPORTEUR ABC - 177
IV DISCUSSION - 180
V BIBLIOGRAPHIE - 184
10
CHAPITRE VII : PROFIL D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS
DES LIGNEES CELLULAIRES SENSIBLES ET RESISTANTES - 191
I INTRODUCTION - 191
1 LA CELLULE CANCEREUSE - 191
2 UN TRAITEMENT ANTICANCEREUX : LA CHIMIOTHERAPIE - 193
2.1 Historique de la chimiothérapie anticancéreuse - 193
2.2 La réponse aux chimiothérapies anticancéreuses - 194
2.3 Le phénomène de chimiorésistance - 194
2.4 Un modèle d’étude de chimiorésistance : les lignées cellulaires résistantes - 195
II RESULTATS - 195
1 LIGNEES CELLULAIRES TESTEES - 195
2 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 197
3 CALCUL DU RATIO D’EXPRESSION RQ - 199
4 CYTOMETRIE DE FLUX - 201
5 QUANTIFICATION DU TRANSPORTEUR ABCB4 - 203
6 ESTIMATION DU NOMBRE DE COPIES DE TRANSCRIT PAR CELLULE - 204
6.1 Utilisation d’une gamme étalon - 204
6.2 Calcul du nombre de copies d’ARN par cellules en utilisant l’ARN ribosomal 18S - 212
III DISCUSSION - 212
IV ANNEXE - 217
V BIBLIOGRAPHIE - 219
DISCUSSION GENERALE - 221
MATERIELS ET METHODES - 225
1 MATERIEL BIOLOGIQUE - 225
1.1 Animaux : - 225
1.2 Les lignées cellulaires : - 225
1.3 Les échantillons de foies humains : - 226
1.4 Les échantillons de blastes humains - 226
2 MANIPULATION D’ARN : - 226
2.1 Extraction d’ARN - 227
2.2 Dosage, contrôle de la pureté, de la stabilité et stockage des ARN - 228
3 PUCES A ADN - 228
3.1 Blocage des lames - 228
3.2 Synthèse et marquage des ADNc - 229
3.3 Hybridation - Lavages - 229
3.4 Acquisition d'images en fluorescence - 230
4 PCR QUANTITATIVE - 231
4.1 PCR en SYBR Green - 231
4.2 PCR Taqman - 232
5 ANALYSE PAR CYTOMETRIE DE FLUX - 232

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