François, Alan (2002) Dégradation d'un composé xénobiotique récalcitrant: métabolisme du méthyl tert-butyl éther (MTBE) par mycobacterium austroafricanum IFP 2012. PhD thesis Microbiologie, INAPG p.174.

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Abstract

Afin d'obtenir le niveau requis d'indice d'octane et de limiter les rejets en monoxyde de carbone, les éthers carburants, principalement le méthyl tert-butyl éther (MTBE), sont incorporés dans les essences. A la suite de fuites, le MTBE est apparu comme un polluant majeur des nappes aquifères en raison de sa très faible biodégradabilité. L'objectif de ce travail a été d'étudier la dégradation du MTBE par Mycobacterium austroafricanum IFP 2012. La voie métabolique a été partiellement élucidée par l'identification de plusieurs intermédiaires (tert-butyl formiate (TBF), tert-butyl alcool (TBA), acide -hydroxyisobutyrique et acétone) et activités enzymatiques (MTBE/TBA mono-oxygénase non-hémique et inductible, TBF estérase, 2-propanol: NDMA oxydoréductase et une mono-oxygénase impliquée dans la dégradation de l'acétone). Le rôle du TBF et la nécessité de cobalt ont été proposés pour expliquer la faible biodégradation du MTBE; le rôle de la liaison méthoxy semblant limité.

Table of content

INTRODUCTION - 1
CHAPITRE 1- ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE - 4
I.Production et composition des essences - 4
II.Contraintes liées au fonctionnement des moteurs - 6
II.1.Masse volumique et volatilité - 6
II.2.Indice d'octane - 6
III.Contraintes liées à la protection de l'environnement - 9
IV.Utilisation des composés oxygénés: alcools ou éthers-carburants - 10
IV.1.Considérations physico-chimiques - 10
IV.2.Considérations économiques - 12
IV.3.Considérations écologiques - 13
V.Les éthers-carburants - 14
V.1.Procédés de fabrication - 14
V.2.Impact de l'utilisation des éthers-carburants dans l'environnement - 14
V.2.A.Contamination de l'environnement - 14
V.2.B.Évaluation de l'atténuation naturelle - 16
V.3.Impact de l'utilisation des éthers-carburants sur les organismes supérieurs - 18
V.3.A.Toxicité/carcinogénicité - 18
V.3.B.Métabolisme des éthers-carburants chez les Eucaryotes supérieurs - 19
V.4.Biodégradation des éthers-carburants - 21
V.4.A.Biodégradation par des microcosmes et des cultures mixtes - 22
V.4.B.Biodégradation par cométabolisme - 24
V.4.C.Biodégradation d'éthers utilisés comme source de carbone et d'énergie - 28
V.4.D.Voies de dégradation proposées - 30
VI.Activités enzymatiques impliquées dans la dégradation du MTBE - 35
VI.1.Les mono-oxygénases - 35
VI.1.A.Généralités - 35
VI.1.B.Les cytochromes P450 - 36
VI.1.C.Mono-oxygénases liées a l'utilisation des alcanes gazeux - 38
VI.1.D.Inactivateurs et inhibiteurs des mono-oxygénases - 40
VI.2.Les estérases - 43
VI.3.Les décarboxylases - 45
VI.3.A.Généralités - 45
VI.3.B.Dégradation de xénobiotiques - 46
VI.3.C.Importance des ions dans les activités décarboxylases - 46
VI.3.D.Cas particulier de l'ion cobalt - 48
VI.4.Les déshydrogénases - 49
VI.4.A.Généralités - 49
VI.4.B.Les alcools déshydrogénases NAD(P)-dépendantes - 50
VI.4.C.Les alcool déshydrogénases NAD(P)-indépendantes - 51
VI.4.D.Les alcool oxydases - 52
VI.4.E.Les alcool: NDMA oxydoréductases - 53
CHAPITRE 2- MATÉRIEL ET MÉTHODES - 55
I.Méthodes microbiologiques - 55
I.1.Micro-organismes et plasmides - 55
I.2.Milieux de culture - 57
I.3.Suivi de l'activité biologique - 59
I.3.A.Suivi de la croissance - 59
I.3.B.Détermination des taux de minéralisation et de recouvrement en carbone - 61
I.3.C.Activités des cellules non proliférantes - 62
II.Méthodes analytiques - 62
II.1.Chromatographies - 62
II.1.A.Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) - 62
II.1.B.Chromatographie en Phase Liquide (HPLC) - 63
II.2.Analyse de la biomasse et de son contenu - 64
II.2.A.Dosage de la biomasse - 64
II.2.B.Extraits cellulaires - 64
II.2.C.Fraction protéique soluble - 64
II.2.D.Fraction protéique membranaire - 65
II.2.E.Dosage des protéines - 65
II.3.Électrophorèses - 66
II.4.Mise en évidence d'activité monooxygénase - 67
II.4.A.Mono-oxygénase hémique - 67
II.4.B.Mono-oxygénase non hémique - 68
II.5.Activité alcool: NDMA oxydoréductase :68
III.Biologie moléculaire - 69
III.1.Identification génétique de M. austroafricanum IFP 2012 - 69
III.2.Préparation de cellules compétentes et transformation bactérienne - 69
III.3.Extraction plasmidique - 70
III.4.Construction du vecteur pMS100 - 71
III.4.A.Préparation du vecteur - 73
III.4.B.Élution de l'insert de 4,9 kb de pGT222 - 73
III.4.C.Ligature du vecteur et de l'insert - 73
III.5.Hybridation sur colonies de Mycobactéries - 74
III.5.A.Préparation de la sonde radioactive des gènes eth - 74
III.5.B.Fixation de l'ADN des Mycobactéries sur filtres - 74
III.5.C.Hybridation avec les gènes eth - 75
CHAPITRE 3 - RÉSULTATS ET DISCUSSION - 76
I.Minéralisation du MTBE par cométabolisme dans des consortia reconstitués - 78
I.1.Etude des capacités de dégradation du TBA par M. austroafricanum IFP 2012 - 78
I.1.A.Substrats de croissance de M. austroafricanum IFP 2012 - 78
I.1.B.Croissance sur TBA de M. austroafricanum IFP 2012 - 79
I.2.Étude de la dégradation du MTBE par des consortia reconstitués - 81
Article 1: Selection of a defined mixed culture for MTBE mineralization - 82
II.Étude de la dégradation du MTBE par M. austroafricanum IFP 2012 - 91
Article 2: Biodegradation of methyl tert-butyl ether and other fuel oxygenates by a new strain,
Mycobacterium austroafricanum IFP 2012 - 93
III.Étude des facteurs limitant la croissance de M. austroafricanum IFP 2012 sur MTBE - 103
Article 3: Roles of tert-butyl formate, tert-butyl alcohol and acetone in the regulation of methyl tert-butyl ether degradation by Mycobacterium austroafricanum IFP 2012107
Article 4: Comparison of MTBE and TAME degradation pathways in Mycobacterium austroafricanum IFP 2012132
IV.Mise en évidence d'une activité alcool déshydrogénase dans le métabolisme du TBA par M. austroafricanum IFP 2012 - 142
IV.1.Identification d'une protéine induite lors de la croissance de M. austroafricanum IFP 2012 sur TBA - 142
IV.2.Mise en évidence d'une activité 2-propanol: NDMA oxydoréductase chez M. austroafricanum IFP 2012 - 143
IV.3.Détermination des constantes cinétiques de l'activité 2-propanol: NDMA oxydoréductase - 146
V.Transformations plasmidiques des Mycobactéries - 147
V.1.Intérêt de la transformation génétique par les gènes eth - 147
V.2.Transformations des Mycobactéries par pCL4D - 148
V.3.Transformation des Mycobactéries par pMS100 - 149
V.4.Croissance de M. smegmatiS mc2 155 (pMS100) sur ETBE - 150
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES - 153
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 159

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