Niquet, Céline (2007) A study of the formation of non-volatile Maillard products from glutamine-derived ammonia: the structure identification of some novel molecules. PhD thesis Chimie analytique, Institut Polytechnique LaSalle Beauvais, F-60026 Beauvais, AgroParistech 2007AGPT0030 p.275.

Full text available as: - Thèse_C_NIQUET_30Oct2007.pdf ( 2454 Kb )

Licence: CC ND 2.0

Abstract

This work concerns the identification of the structure and mechanisms of formation of

some non-volatile Maillard reaction products (MRPs). The principle goal was to achieve a

better understanding of the precursory role of the glutamine. Unlike that of the volatile

molecules, the knowledge of non-volatile compounds is very limited. Moreover glutamine

with a similar structure to asparagine has two nitrogen atoms likely to take part in the

Maillard reaction: the α-amine and ammonia resulting from a lactamisation. In this context

we looked for, isolated and characterized the non-volatile MRPs which are likely to be

formed during the heat treatment of foods rich in glutamine or ammonia. Using various

analytical tools (HPLC, fluorescence, mass spectrometry, NMR …) we detected four

fluorophores resulting from the reaction between glutamine and methylglyoxal. One of them,

the 5-hydroxy-2,6-dimethylnicotonic acid (HDNA), was identified as being the main

fluorophore formed. A second simple model with glutamine and glucose enabled us to

identify two poly-hydroxyalkyl-pyrazines partially studied in the literature. Finally the search

for these MRPs in some foodstuffs revealed the presence of the two non-volatile pyrazines in

various heated tomato sauces (glutamine-rich foods) and in biscuits containing ammonium

bicarbonate. The presence of the HDNA in food remains to be checked. In the future it will be

important to evaluate the organoleptic properties and the physiopathological impact of these

ingested MRPs.

Table of content

LISTE DES ABREVIATIONS - 8

LISTE DES FIGURES ET TABLEAUX - 10

INTRODUCTION - 20

PARTIE I ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE - 24

CHAPITRE I : MECANISMES A L’ORIGINE DU BRUNISSEMENT DES ALIMENTS - 25

I. Le brunissement enzymatique - 25

II. La caramélisation - 26

III. La réaction de Maillard - 28

1. Etape initiale - 31

2. Etape de propagation et avancée - 32

3. Etape finale - 35

CHAPITRE II : PROPRIETES DES PRODUITS ISSUS DE LA REACTION DE MAILLARD - 36

I. Qualité organoleptique - 36

II. Texture - 37

III. Perte de qualité nutritionnelle des aliments associée à la réaction de Maillard ... 37

IV. Impact de la réaction de Maillard sur la santé - 39

1. Effets néfastes des produits de Maillard sur la santé - 39

2. Les mélanoïdines : leur pouvoir antioxydant et leur action prébiotique - 43

3. Effets détoxifiants des produits de Maillard - 43

CHAPITRE III : IMPLICATION DES ACIDES AMINES LIBRES DANS LA REACTION DE MAILLARD 46

I. La réaction de Maillard : facteurs mis en jeu et paramètres influents - 47

1. Réactivité des acides aminés - 47

2. Réactivité des cétoses, aldoses et composés α-dicarbonylés - 49

3. pH - 52

a. Etude sur différents modèles - 52

b. pH dans les aliments - 54

c. Effet de la nature du tampon et de sa concentration - 55

4. Couple Temps/Température - 56

5. Activité d’eau - 57

II. Les acides aminés libres dans les aliments - 59

III. L’exemple de l’asparagine - 63

IV. La glutamine et l’ammoniac : implication dans la réaction de maillard - 65

1. Les produits de dégradation spécifiques de la glutamine - 65

2

a. L’acide pyroglutamique - 66

b. Le 3-butenamide - 67

c. Transamidification avec la lysine - 68

2. Les produits de dégradation non-spécifiques de la glutamine - 69

a. Les imidazoles - 70

b. Les pyrazines - 71

c. Les pyridines - 73

d. L’acrylamide - 73

e. Les autres sources d’ammoniac - 75

OBJECTIF - 78

PARTIE II MATERIEL ET METHODES - 81

CHAPITRE I : PRODUITS CHIMIQUES ET INSTRUMENTATION - 82

I. Les produits chimiques - 82

II. Les tampons - 83

III. Préparation de modèles simples - 83

IV. Filtration des échantillons et des solvants pour HPLC - 83

V. HPLC/UV-Fluo - 84

VI. Collecteur de fraction - 84

VII. LC-MS - 85

1. Généralités sur le spectromètre de masse LTQ - 85

2. La source d’ionisation par électrospray - 86

3. Les solvants et les débits d’élution chromatographique sélectionnés pour nos

analyses LC-MS - 87

4. La trappe d’ions linéaire (l’analyseur de masse) - 87

VIII. MS-Q-TOF - 89

IX. Autres Spectrométries - 89

X. Evaporation-Concentration - 90

XI. Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) - 90

1. Spectres RMN à une dimension (1D) - 91

2. Spectres RMN à deux dimensions (2D) - 91

a. Spectres RMN à deux dimensions homonucléaires - 91

b. Spectres RMN à deux dimensions hétéronucléaires - 92

CHAPITRE II : METHODES - 92

3

I. Dosage des acides aminés - 92

1. Principe - 92

2. Protocole - 93

a. Préparation des différentes solutions - 93

b. Dérivation - 93

c. Conditions chromatographiques - 94

d. Exemple de chromatogramme - 95

II. Dosage de l’acide pyroglutamique - 96

1. Principe - 96

2. Protocole - 96

a. Conditions chromatographiques - 96

b. Exemple de chromatogramme - 97

III. Dosage de l’ammoniac - 98

1. Principe - 98

2. Protocole - 98

IV. Purification et concentration de quelques produits de Maillard - 100

1. Principe - 100

2. Procédé - 101

V. Préparation d’un échantillon d’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique en vue

d’une analyse RMN - 102

VI. Analyse statistique - 103

PARTIE III RESULTATS EXPERIMENTAUX ET DISCUSSION - 104

CHAPITRE I : ETUDE DE LA DEGRADATION DE LA GLUTAMINE EN MILIEU AQUEUX - 105

I. Influence du pH et de la température sur la dégradation de la glutamine en acide

pyroglutamique - 105

1. Protocole expérimental - 105

2. Résultats et discussion - 106

II. Comparaison du taux de formation d’ammoniac par dégradation de la glutamine

et autres précurseurs - 109

1. Protocole expérimental - 110

2. Résultats et discussion - 110

CHAPITRE II : ETUDE DE LA REACTION ENTRE LA GLUTAMINE ET LE METHYLGLYOXAL - 114

I. Etude de la formation de chromophores et de fluorophores - 115

4

1. Cinétiques de formation de chromophores et de fluorophores en fonction du

rapport molaire Gln/MG - 116

a. Protocole expérimental - 116

b. Résultats - 116

c. Discussion - 120

2. Comparaison de la formation de pigments bruns et de fluorophores entre

différents précurseurs d’ammoniac - 121

a. Protocole expérimental - 121

b. Résultats et discussion - 122

c. Discussion - 123

3. Comparaison des profils chromatographiques de deux mélanges glutamine +

méthylglyoxal et ammoniac + méthylglyoxal - 124

a. Conditions chromatographiques - 125

b. Résultats et discussion - 126

4. Dosage de l’acide pyroglutamique formé à partir d’un mélange glutamine +

méthylglyoxal - 129

II. Etude de quatre fluorophores produits par réaction entre la glutamine et le

méthylglyoxal - 130

1. Introduction - 131

2. Identification structurale des quatre fluorophores - 132

a. Séparation de chacun des fluorophores - 132

b. Caractéristiques spectrales - 135

c. Recherche de fonctions hydroxylées et carboxyliques sur le principal

fluorophore - 141

d. Analyse du nombre de protons dits « échangeables » sur le fluorophore

majoritaire - 143

e. Estimation du nombre d’atomes de carbone et d’azote - 143

f. Détermination du nombre d’atomes d’azote - 148

g. Caractérisation de la formule brute - 149

h. Analyse RMN - 151

i. Présentation de la formule chimique développée de l’acide 5-hydroxy-2,6-

diméthylnicotinique - 154

j. Proposition de structures pour les autres fluorophores - 158

3. Extraction de l’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique au dichlorométhane 162

5

4. Etude de stabilité de l’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique - 164

a. Protocole expérimental - 164

b. Résultats et discussion - 165

5. Cinétiques de formation des quatre fluorophores en fonction du pH et de la

température - 166

a. Protocole expérimental - 166

b. Résultats - 167

6. Influence de différents précurseurs d’ammoniac sur la formation de l’acide 5-

hydroxy-2,6-diméthylnicotinique - 175

a. Protocole expérimental - 175

b. Résultats et discussion - 176

7. Mesure de la contribution de l’α-amine de la glutamine dans la formation de

l’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique - 177

a. Protocole expérimental - 177

b. Résultats et discussion - 177

8. Etude de l’influence du pyroglutamate sur la formation de l’acide hydroxydiméthylnicotinique -

181

a. Protocole expérimental - 181

b. Résultats et discussion - 181

9. Etude de la réaction entre l’ammoniac et le méthylglyoxal en compétition avec le

glucose - 182

a. Protocole expérimental - 183

b. Résultats et discussion - 183

III. Conclusion - 184

CHAPITRE III : ETUDE DE LA REACTION ENTRE LA GLUTAMINE ET LES SUCRES REDUCTEURS

- 187

I. Analyse LC-UV-MS d’un mélange glutamine/glucose - 187

II. Caractéristiques spectrales - 190

III. Caractérisation de la formule brute - 193

1. Détermination du nombre d’atomes d’azote - 193

2. Détermination du nombre d’atomes de carbone - 194

3. Analyse des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines par MS-Q-TOF - 195

4. Identification structurale des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines - 196

IV. Extraction des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines au dichlorométhane - 201

6

V. Etude du mécanisme de formation des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines - 202

1. Etude de l’effet pseudo-catalytique du glyoxal et du méthylglyoxal dans la

formation des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines - 204

a. Protocole expérimental - 204

b. Résultats et discussion - 204

2. Estimation de la contribution des deux composés α-dicarbonylés dans la

formation des deux poly-hydroxyalkyl-pyrazines - 207

a. Protocole expérimental - 208

b. Résultats et discussion - 208

VI. Cinétiques de formation de la trihydroxybutyl-pyrazine et de la méthyltétrahydroxybutyl-

pyrazine en fonction de la température - 210

1. Protocole expérimental - 210

2. Résultats et discussion - 210

VII. Mesure de la contribution de l’α-amine de la glutamine dans la formation de la 2-

(2’,3’,4’-trihydroxybutyl)pyrazine - 212

1. Protocole expérimental - 212

2. Résultats et discussion - 213

VIII. Influence de la nature du précurseur d’ammoniac sur la formation de la 2-

(2’,3’,4’-trihydroxybutyl)pyrazine - 214

1. Protocole expérimental - 214

2. Résultats et discussion - 215

IX. Influence de différents sucres réducteurs - 217

1. Protocole expérimental - 217

2. Résultats et discussion - 217

X. Conclusion - 219

CHAPITRE IV : RECHERCHE DE L’ACIDE 5-HYDROXY-2,6-DIMETHYLNICOTINIQUE ET DES

POLY-HYDROXYALKYL-PYRAZINES DANS DEUX MATRICES ALIMENTAIRES - 223

I. La tomate et ses produits dérivés - 223

1. Dosage de la glutamine libre dans notre échantillon de tomate fraîche - 224

2. Protocole de traitement thermique des matrices « tomate » et d’extraction de

l’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique - 225

3. Recherche de l’acide 5-hydroxy-2,6-diméthylnicotinique - 226

a. Tomate fraîche - 226

b. Sauce tomate de marque Buitoni - 228

7

c. Sauce brune et ketchup - 230

d. Ajouts de glutamine/ammoniac/méthylglyoxal dans la tomate fraîche - 231

e. Ajouts de glutamine et de méthylglyoxal dans la sauce Buitoni - 236

4. Recherche des poly-hydroxyalkyl-pyrazines - 237

a. Tomate fraîche - 238

b. Sauce Buitoni - 242

c. Sauce brune et ketchup - 245

II. Les biscuits - 247

1. Protocole d’extraction - 247

2. Biscuits du commerce - 248

3. Des biscuits modèles - 251

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES - 253

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 259

ANNEXES - 273

ANNEXE I - 274

ANNEXE II - 275

Statistiques de consultation

Repository Staff Only: edit this item