Couesnon, Aurélie (2007) Passage of botulinum neurotoxin across intestinal barrier. PhD thesis Biologie, Institut Pasteur, Unité des Bactéries Anaérobies et Toxines, F-75015, AgroParistech 2007AGPT0065.
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Abstract
paralysis, is produced by anaerobic bacteria of the Clostridium genus. BoNTs are classified
into 7 types (A to G) and form different complexes by association with non-toxic proteins,
including the non-toxic non-hemagglutinin component (NTNH) and hemagglutinins (HAs).
En coding genes are clustered in the botulinum locus and organized in two divergent operons,
ntnh-bont/A and ha34-ha17-ha70 for type A, whose expressions are positively regulated by
the alternative sigma factor BotR. A synchronous expression peak of all the botulinum locus
genes is measured by real-time RT-PCR at the transition between exponential and stationary
growth phases, concomitantly to toxin accumulation in culture supernatant. In an intestinal
epithelium model, purified BoNT/A is transcytosed after binding, via the Hc/A domain, to
apical receptors including gangliosides and putative SV2-related proteins. Binding affinity
and transport efficiency into intestinal cells are higher with crypt-type than with enterocytetype
cell lines. Injected into the lumen of ligatured mouse ileal loops, BoNT/A inhibits
smooth muscle contractions and fluorescent Hc/A migrates across mucosa, through some
crypt cells, to submucosa and musculosa where it targets certain nerve endings, mostly
cholinergic. Hc /A is internalized via different pathways into neuronal cells (dynamin- and
clathrin-dependent) and intestinal cells (dynamin- and Cdc42-dependent, and clathrinindependent).
| Item Type: | PhD Thesis (PhD) |
|---|---|
| Thesis Supervisor: | Popoff, Michel Robert and Meunier, Jean-Claude |
| Date: | 21 November 2007 |
| Board of examiners: | Poulain, Bernard and Gillet, Daniel and Molgo, Jordi and Dane, Claire |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biologie |
| Collection (Fonds): | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Department: | Institut Pasteur, Unité des Bactéries Anaérobies et Toxines, F-75015 |
| Subjects: | 7. Life Sciences and Engineering |
| Uncontrolled Keywords: | Clostridium botulinum, Toxine, Régulation transcriptionnelle, Intestin, Récepteurs membranaires, Trafic intracellulaire., Clostridium botulinum, Toxin, Transcriptional regulation, Intestine, Membrane receptors, Intracellular trafficking. |
| ID Code: | 3461 |
| Deposited By: | Nadine Pontal |
| Deposited On: | 27 February 2008 |
Table of content
1 L’agent du botulisme et ses armes létales, les neurotoxines
botuliques - 9
1.1 Historique - 9
1.2 Formes de botulisme - 11
1.2.1 Intoxination botulique - 11
1.2.2 Toxi-infection botulique - 11
1.2.3 Botulisme par blessure - 11
1.3 Manifestations cliniques et traitement du botulisme - 13
1.4 Agent du botulisme : organisme et habitat - 15
1.4.1 Caractéristiques physiologiques des Clostridium neurotoxinogènes - 15
1.4.2 Classification des Clostridium neurotoxinogènes - 15
1.4.3 Habitat des Clostridium neurotoxinogènes - 17
1.5 Neurotoxines et complexes botuliques : organisation des protéines
et des gènes associés - 19
1.5.1 Formation des complexes botuliques - 19
1.5.1.1 Découverte des complexes - 19
1.5.1.2 Structure des complexes - 21
1.5.1.3 Caractéristiques des BoNTs et des ANTPs - 23
1.5.2 Structure des BoNTs - 25
1.5.3 Diversité génétique des souches de Clostridium neurotoxinogènes - 27
1.5.3.1 Caractéristiques des gènes du locus botulique - 27
1.5.3.2 Localisation génomique et transfert de gènes du locus botulique - 31
1.5.4 Organisation génétique du locus botulique - 35
1.6 Régulation des gènes du locus botulique - 39
2 Interaction de la neurotoxine botulique avec l’intestin - 43
2.1 Description anatomique et fonctionnelle du tractus gastrointestinal
des mammifères - 43
2.2 Structure de la paroi intestinale - 43
2.2.1 La muqueuse intestinale - 45
2.2.1.1 Les villosités intestinales - 45
2.2.1.2 Les cryptes intestinales - 47
2.2.2 La sous-muqueuse - 49
2.2.3 La musculeuse - 51
2.2.4 La séreuse - 51
2.3 Système nerveux entérique - 53
2.3.1 Système nerveux entérique extrinsèque - 53
2.3.2 Système nerveux entérique intrinsèque - 55
2.3.3 Automatisme et contrôle nerveux de la motricité digestive - 59
2.3.4 Le système glial entérique - 63
2.4 Etudes in vivo de l’interaction de BoNT/A avec l’intestin - 64
2.4.1 Mise en évidence d’une corrélation entre stabilité et toxicité des complexes
botuliques - 64
2.4.2 Passage de la neurotoxine à travers la barrière intestinale : voies
transcellulaire et paracellulaire - 66
2
3 Liaison, entrée et trafic des neurotoxines botuliques dans les
cellules neuronales et intestinales - 69
3.1 Liaison des neurotoxines botuliques aux récepteurs cellulaires - 71
3.1.1 Les gangliosides - 71
3.1.1.1 Liaison des BoNTs aux gangliosides - 73
3.1.1.2 Liaison des hémagglutinines aux gangliosides - 75
3.1.2 Les protéines impliquées dans la liaison des BoNTs aux cellules - 77
3.1.2.1 Les synaptotagmines I et II - 77
3.1.2.2 La protéine des vésicules synaptiques SV2 - 79
3.2 Voies d’entrée des BoNTs dans les cellules - 85
3.2.1 Organisation de la membrane plasmique en microdomaines - 85
3.2.2 Principales voies d’entrée dans les cellules - 87
3.2.2.1 Organisation des cellules épithéliales et du trafic endocytotique - 89
3.2.2.2 Caractéristiques des voies d’endocytose - 91
3.2.3 Internalisation et translocation des neurotoxines dans les cellules
neuronales - 95
3.2.3.1 Cycle des vésicules synaptiques - 95
3.2.3.2 Internalisation de le neurotoxine tétanique - 95
3.2.3.3 Internalisation de la neurotoxine botulique - 97
3.2.3.4 Translocation des BoNTS dans le cytosol neuronal - 97
3.2.4 Transport des BoNTs à travers les cellules intestinales - 99
3.2.4.1 Mécanisme de la transcytose - 99
3.2.4.2 Exemples de transcytose à travers des modèles de barrière intestinale - 99
3.2.4.3 Mise en évidence du transport des complexes botuliques sur un modèle
d’épithélium intestinal - 103
3.3 Activité enzymatique des BoNTs au niveau des terminaisons
nerveuses - 109
4 Résultats - 115
4.1 Article n°1 : Expression des gènes des neurotoxines botuliques A et
E et des gènes des protéines non toxiques associées pendant la transition
de phase et stabilité à haute température : Analyse par PCR en temps réel
en transcription inverse - 115
4.1.1 Résumé - 115
4.1.2 Souches de C. botulinum utilisées - 115
4.1.3 Quantification de l’expression des gènes du locus botulique et de la
production de toxine - 116
4.1.4 Stabilité des BoNTs et des ANTPs à température élevée - 117
4.2 Article n°2 : Transcytose médiée par récepteur de la neurotoxine
botulique A à travers des monocouches de cellules intestinales - 119
4.2.1 Résumé - 119
4.2.2 Choix du modèle de barrière intestinale et des lignées cellulaires - 119
4.2.3 Transcytose de BoNT/A à travers les Caco-2 et les m-ICcl2 - 120
4.2.3.1 Caractéristiques du passage - 120
4.2.3.2 Spécificité de BoNT/A - 120
4.2.4 Caractérisation des récepteurs de BoNT/A sur les cellules intestinales ..121
4.2.4.1 Spécificité de la liaison - 121
3
4.2.4.2 Rôle des gangliosides - 121
4.2.4.3 Rôle d’une protéine apparentée à SV2 - 121
4.3 Article n°3 : La neurotoxine botulique A passe à travers la
muqueuse intestinale de souris et cible localement certaines terminaisons
nerveuses - 123
4.3.1 Résumé - 123
4.3.2 BoNT/A, injectée dans la lumière d’anses intestinales ligaturées, inhibe les
contractions spontanées de l’iléum - 123
4.3.3 Distribution des sites potentiels de liaison de Hc/A dans l’iléum de souris
124
4.3.4 Passage de la muqueuse et liaison de Hc/A aux cellules neuronales
intestinales - 124
4.3.5 Types de neurones ciblés par Hc/A et localisation de SV2C dans le système
nerveux entérique - 125
4.3.5.1 Cellules neuronales ciblées par le Hc/A dans la sous-muqueuse - 125
4.3.5.2 Cellules neuronales ciblées par le Hc/A dans la musculeuse - 125
4.3.5.3 Le récepteur neuronal SV2 de BoNT/A est exprimé par certaines cellules
neuronales et gliales intestinales - 125
4.4 Article n°4 : La neurotoxine botulique A entre par des voies
différentes dans les cellules neuronales et intestinales - 127
4.4.1 Résumé - 127
4.4.2 Cinétique d’entrée de Hc/A dans les cellules neuronales (NG108-15) et
dans les cellules intestinales (Caco-2 et m-ICcl2) - 127
4.4.3 Caractéristiques de la liaison de Hc/A à la membrane cellulaire - 128
4.4.4 Voies d’entrée de Hc/A dans les cellules neuronales et intestinales - 128
4.4.4.1 Une voie d’entrée de Hc/A dans les cellules intestinales est dépendante de
Cdc42 129
4.4.4.2 L’internalisation de Hc/A est dépendante de la dynamine - 129
5 Discussion et perspectives - 131
5.1 Discussion - 131
5.1.1 L’expression synchrone des gènes de la neurotoxine botulique, des
protéines associées et du régulateur BotR est finement régulée lors de la croissance
bactérienne - 131
5.1.2 BoNT/A passe la muqueuse intestinale par un mécanisme de transcytose
qui a lieu préférentiellement au niveau des cryptes intestinales - 134
5.1.3 BoNT/A, injectée dans la lumière intestinale, cible préférentiellement des
terminaisons nerveuses cholinergiques dans la sous-muqueuse et la musculeuse
intestinale - 137
5.1.4 Les voies d’endocytose empruntées par le domaine Hc de BoNT/A
diffèrent en partie dans les cellules neuronales et intestinales - 140
5.2 Perspectives - 142
6 Bibliographie - 145
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