Lopez del castillo - lozano, Micloth (2007) Volatiles sulphur compounds production by cheese-ripening micro flora: Catabolism of Lcysteine. PhD thesis Science des aliments, AgroParistech 2007AGPT0010 p.213.

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Abstract

Due to their low odour threshold values volatile sulphur compounds (VSC)

significantly contribute to the cheese flavour, even at low concentrations. Until now, the

studies related to the production of VSC by cheese ripening microorganisms have been

focused on the methionine catabolism, without paying attention to the possible contribution of

cysteine in their production. This work aimed thus to establish the contribution of cysteine in

the production of VSC by cheese-ripening yeasts and bacteria.

In the first part of this work, five yeasts and four bacteria were selected among 37

strains, based on their capacity to produce H2S, the main degradation product of cysteine. This

selection was achieved by using a practical adaptation of the methylene blue reaction, which

enabled the simultaneous growth of microorganims, the collection and accurate quantification

of H2S.

In the second part of this work, the production of VSC by the selected strains was then

assessed with the addition of cysteine, methionine or methionine-cysteine mixtures to the

microbial cultures.

By adding cysteine, no new VSC was produced by yeasts and only low concentrations

of VSC were quantified in the bacterial cultures. With the methionine addition, the yeast

strains followed two degradation pathways of methionine, and produced methional/methionol

or DMDS/DMTS. Two new volatile sulphur compounds were also characterized: one of them

is a thiophenone, 2-methyl-tetrahydrothiophene-3-one, and the other one is a 1,3-oxathiane. In

addition, the bacteria produced VSC (DMDS, DMTS, DMQS and some thioesters) which

have been already identified as the main products of methionine catabolism. With mixtures of

methionine-cysteine, the production of VSC was more or less decreased depending on the

concentration of the added cysteine. This effect seems to be a consequence of the limitation of

the methionine catabolism by the added cysteine.

Although this effect remains strain dependant, changes in the VSC profiles were

observed in all the cases. Hence, in the bacteria, we observed a major production of the

polysulphides DMTS and DMQS, with a parallel decrease in the concentrations of thioesters,

when they were produced. In yeasts, a similar decrease was observed in the concentration of

methional/methionol and in the concentrations of thioesters, but without any increase in the

production of polysulphides. The low concentration of the solubilized form of H2S (HS- and

S2-) in the acid medium used for yeasts may explain this result.

Preliminary sniffing tests showed that the addition of low cysteine concentrations,

with the simultaneous addition of methionine, produced flavour notes very close to ripened

cheeses. Thus, and in a cheese-making context, we can reasonably suppose that H2S produced

by cysteine catabolism would not take part in the modification of VSC profile at the

beginning of ripening, because of the acid character of curd during this period. However, the

following increase in the pH, as a consequence of the deacidification promoted by yeasts

development, can increase the reactivity of H2S and thus, with a simultaneous production of

methanethiol by the bacterial catabolism of methionine, could provide a better balance

between polysulphides and thioesters. Thus, the co-production of these sulphur molecules by

ripening yeasts and bacteria could improve the development of cheese ripened flavours.

Table of content

SOMMAIRE DES FIGURES - V

SOMMAIRE DES TABLEAUX - VII

LISTE DES ANNEXES - IX

LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS - X

INTRODUCTION 1

A. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. LE PROCESSUS D'AFFINAGE DU FROMAGE - 7

I.1. PROTEOLYSE ET GENERATION DES COMPOSES D'AROMES - 7

I.1.1. Les caséines : principales protéines dans le caillé - 8

I.1.2. Complexes enzymatiques impliqués dans la dégradation des protéines - 11

I.1.2.1. Activité protéolytique du levain lactique - 12

I.1.2.2. Activité protéolytique des flores d'affinage - 12

I.1.2.2.1. Des bactéries propioniques - 13

I.1.2.2.2. Des bactéries de surface - 13

I.1.2.2.3. Des levures et moisissures - 14

I.1.3. Principales enzymes impliquées dans le catabolisme des acides aminés libres - 15

I.1.3.1. Les transaminases - 16

I.1.3.2. Les décarboxylases - 19

I.1.3.3. Les déshydrogénases - 20

I.1.3.4. Les lyases - 22

II. BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES : L-CYSTEINE ET LMETHIONINE - 23

II.1. ASSIMILATION DU SOUFRE - 24

II.2. BIOSYNTHESE DE LA L-CYSTEINE - 27

II.3. BIOSYNTHESE DE LA L-METHIONINE - 29

II.4. CONSERVATION DU SOUFRE REDUIT DANS LE GLUTATHION - 30

II.5. TRANSPORT DU SULFATE, DE LA L-CYSTEINE ET DE LA L-METHIONINE - 31

III. GENESE DES COMPOSES SOUFRES VOLATILS - 33

III.1. CATABOLISME DE LA L-METHIONINE - 33

III.2. CATABOLISME DE LA L-CYSTEINE - 40

III.3. LES COMPOSES SOUFRES VOLATILS DANS LE FROMAGE - 47

III.3.1. Le méthanethiol et le méthional - 47

III.3.2. Les polysulfures - 49

III.3.3. Les thioesters - 52

III.3.4. Le sulfure d’hydrogène ou H2S - 54

III.4. METHODES DE QUANTIFICATION DE L'H2S - 55

IV. LA FLORE D'AFFINAGE DES FROMAGES A PATE MOLLE - 58

IV.1. LES LEVURES - 58

IV.1.1. Le genre Debaryomyces - 58

IV.1.2. Le genre Geotrichum - 59

IV.1.3. Le genre Kluyveromyces - 60

II

IV.1.4. Le genre Saccharomyces - 60

IV.1.5. Le genre Yarrowia - 61

IV.2. LES BACTERIES - 62

IV.2.1. Le genre Arthrobacter - 63

IV.2.2. Le genre Brevibacterium - 63

IV.2.3. Le genre Corynebacterium - 64

IV.2.4. Le genre Microbacterium - 65

IV.2.5. Le genre Staphylococcus - 65

B. MATERIELS ET METHODES

V. MATERIEL MICROBIOLOGIQUE - 69

V.1. COLLECTION DE SOUCHES UTILISEES - 69

V.1.1. Conservation des souches - 69

V.1.2. Pureté des cultures - 69

VI. CONDITION DE CULTURE DES MICRO-ORGANISMES - 71

VI.1. PRE-CULTURES EN MILIEU COMPLEXE - 71

VI.2. ETUDE I. CRIBLAGE DES SOUCHES POUR LA PRODUCTION DE SULFURE D’HYDROGENE

(H2S) ……………………………………………………………………………………………..71

VI.2.1. Préparation des flacons piège pour l'H2S - 72

VI.3. ETUDE II : EFFET DE LA CYSTEINE SUR LA PRODUCTION DE CSV - 73

VII. ANALYSES REALISEES SUR LES CULTURES - 74

VII.1. ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES - 74

VII.1.1. Mesure du pH - 74

VII.1.2. Mesure de l’absorbance - 74

VII.1.3. Mesure du poids sec - 74

VII.2. ANALYSES CHIMIQUES - 74

VII.2.1. Dosage de la L-cystéine - 74

VII.2.1.1. Méthode par dérivation au DTNB - 74

VII.2.1.2. Réaction à la ninhydrine acide - 76

VII.2.2. Dosage de l’H2S par synthèse du bleu de méthylène - 77

VII.3. DOSAGES DES COMPOSES NON VOLATILS PAR CLHP - 78

VII.3.1. Dosage de la L-méthionine résiduelle - 78

VII.3.2. Dosage des cétoacides et des hydroxyacides - 79

VII.4. DOSAGES DES COMPOSES PAR CPG-SM - 79

VII.4.1. Les composés volatils - 79

VII.4.1.1. Extraction par analyse dynamique de l’espace de tête (purge and trap) - 79

VII.4.1.2. Extraction par SPME - 81

VII.4.2. Séparation, détection et quantification des composés volatils - 81

VII.4.3. Les composés non-volatils : Dérivation et analyse par GC-MS - 82

VII.4.3.1. Protocole de double dérivation - 82

VII.4.3.2. Analyse par CPG-SM - 84

VII.5. DOSAGES ENZYMATIQUES - 85

VII.5.1. Préparation des extraits acellulaires - 85

VII.5.2. Dosage des protéines - 85

VII.5.3. Dosage de l’activité déméthiolase - 86

VII.5.4. Dosage de l’activité cystathionine β−γ-lyase - 87

VII.5.5. Dosage de l’activité transaminase - 89

VII.6. ANALYSE STATISTIQUE - 92

III

C. RESULTATS ET DISCUSSION

VIII. MISE AU POINT DES TECHNIQUES - 95

VIII.1. MISE AU POINT DU TEST DE CRIBLAGE : DOSAGE DE L'H2S - 95

VIII.1.1. Test de dosage de l’H2S par précipitation avec des métaux - 95

VIII.1.2. Méthode de dosage de l'H2S par la réaction de synthèse du bleu de méthylène - 97

VIII.2. MISE AU POINT DU DOSAGE DE LA CYSTEINE - 101

VIII.2.1. Dosage par dérivation au DTNB et séparation par CLHP - 101

VIII.2.2. Dosage par réaction à la ninhydrine acide - 103

VIII.2.3. Perte de la cystéine par oxydation en milieu complexe - 104

IX. CRIBLAGE DES SOUCHES ET PRODUCTION DE COMPOSES SOUFRES

VOLATILS DANS DES MILIEUX SYNTHETIQUES ENRICHI EN L-CYSTEINE - 109

X. EFFET DE LA CYSTEINE SUR LA PRODUCTION DE CSV DANS DES MILIEUX

ENRICHIS EN METHIONINE ET EN CYSTEINE - 119

X.1. ETUDE CHEZ LES BACTERIES SELECTIONEES - 120

X.1.1. Etude de B. aurantiacum ATCC 9175 et C. glutamicum COD13 - 121

X.1.1.1. Croissance des bactéries - 121

X.1.1.2. Effet de l'addition de cystéine sur la production totale de CSV - 121

X.1.1.3. Effet de l'addition de cystéine sur la composition du profil de CSV - 123

X.1.1.4. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 123

X.1.1.5. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 124

X.1.1.6. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 125

X.1.1.7. Discussion et Conclusions - 127

X.1.2. Etude d’Arthrobacter spp 7(2) et de B. linens BL918 - 129

X.1.2.1. Effet de l'addition de cystéine sur la production totale de CSV - 133

X.1.2.2. Effet de l'addition de cystéine sur la composition du profil de CSV - 135

X.1.2.3. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 135

X.1.2.4. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 137

X.1.2.5. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 138

X.1.2.6. Effet de la cystéine sur l'évaluation sensorielle des cultures - 140

X.1.2.7. Discussion et Conclusions - 141

X.2. ETUDE CHEZ LES LEVURES SELECTIONNEES - 143

X.2.1. Résultats - 147

X.2.1.1. Croissance des levures - 147

X.2.1.2. Production de CSV à partir de la méthionine - 147

X.2.1.3. Production d’H2S et de CSV à partir des mélanges de méthionine-cystéine - 148

X.2.1.4. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 150

X.2.1.5. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 152

X.2.1.6. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 154

X.2.1.7. Effet de la cystéine sur l'évaluation sensorielle des cultures - 155

X.2.2. Discussion et Conclusions - 157

D. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES…………….……..……169

E. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………..………….. 177

F. ANNEXES………………………………………………………… - 205

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