Le Moal, Eric (2007) Développement et organisation de nanostructures : applications à l’exaltation des processus optiques pour la Biologie. PhD thesis Physique, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI), ESPCI p.206.

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Abstract

La fluorescence d’une molécule est sensible à son environnement électromagnétique. La présence d’une structure métallique modifie l’excitation et l’émission des fluorophores, par le jeu d’interférences et de couplages avec les plasmons de surface. Nous avons élaboré et caractérisé des films métalliques de différentes morphologies (films de nanoparticules, percolés, continus, plans, rugueux. . .). Leur influence sur la réponse optique des fluorophores a été étudiée par la modélisation puis l’expérience, en fonction de la distance fluorophore-métal et de l’orientation moléculaire. Une amplification d’un à deux ordres de grandeur du signal détecté est observée, ainsi qu’une photostabilisation des fluorophores et une modification des transferts d’énergie intermoléculaires. Nous démontrons l’intérêt de cette technologie pour améliorer la sensibilité dans les puces à ADN et pour l’imagerie des cellules et des tissus.

Table of content

Remerciements v



Introduction xi



1 Contexte et état de l’art 1



1.1 Fluorescence appliquée à l’imagerie des systèmes biologiques - 2

1.1.1 Mécanismes de la fluorescence moléculaire - 2

1.1.2 Le marquage fluorescent en biologie - 10



1.2 Nature et propriétés des plasmons - 14

1.2.1 Qu’est-ce qu’un plasmon ? - 15

1.2.2 Plasmons localisés dans les nanoparticules métalliques - 16

1.2.3 Plasmons de surface - 16

1.2.4 Comment coupler photons et plasmons de surface ? - 20



1.3 Processus optiques en présence d’une structure métallique - 25

1.3.1 Interaction émetteur ponctuel / miroir métallique - 25

1.3.2 Interaction émetteur ponctuel / surface métallique structurée . . 33

1.3.3 Couplage émetteur ponctuel / nanoparticule métallique - 35



1.4 Enjeux de l’exaltation des processus optiques en biologie - 43

1.4.1 Imagerie cellulaire et tissulaire - 43

1.4.2 Puces à ADN - 46



2 Méthodes expérimentales et de simulation 53



2.1 Préparation des substrats métallisés - 53

2.1.1 Fabrication - 53

2.1.2 Caractérisation optique et morphologique - 57

2.1.3 Dépôt des fluorophores - 64



2.2 Techniques pour les applications biologiques - 67

2.2.1 Puces à ADN - 67

2.2.2 Méthodes pour l’imagerie cellulaire et tissulaire - 71



2.3 Méthodes optiques - 75

2.3.1 Microscopie de fluorescence monophotonique - 75

2.3.2 Microscopie de fluorescence biphotonique résolue en temps . . . 76

2.3.3 Spectroscopie de fluorescence monophotonique - 79



2.4 Modélisation de l’interaction fluorophore/substrat - 80

2.4.1 Géométrie des systèmes modélisés - 80

2.4.2 Modèle de l’oscillateur dipolaire (théorie CPS) - 81

2.4.3 Figures spatiales de rayonnement - 83

2.4.4 Normalisation par rapport au taux d’excitation - 84

2.4.5 Modélisation des échantillons d’épaisseur micrométrique - 85

2.4.6 Modélisation de la perte de stigmatisme - 86



3 Fluorescence moléculaire sur un film métallique nanostructuré 89



3.1 Résonance plasmon accordable - 90



3.2 Mise en évidence des couplages métal-fluorophore - 92

3.2.1 Couplage à l’excitation - 93

3.2.2 Couplage à l’émission - 96



3.3 Conclusion - 101



4 Fluorescence et couplage intermoléculaire sur un film plan 103



4.1 Modifications des processus optiques - 104

4.1.1 Exaltation à l’excitation - 104

4.1.2 Exaltation à l’émission - 105

4.1.3 Amélioration de la collection - 108

4.1.4 Amplification du signal - 111

4.1.5 Exaltation de la fluorescence biphotonique - 114



4.2 Effet miroir pour les échantillons épais - 119

4.2.1 Particularités des échantillons d’épaisseur micrométrique - 119

4.2.2 Amplification moyenne du signal - 120

viii

4.2.3 Distribution angulaire de l’émission de fluorescence - 121



4.3 Photostabilisation des fluorophores - 124

4.3.1 Effets électromagnétiques - 124

4.3.2 Mesure expérimentale de la photostabilité des fluorophores . . . 125

4.3.3 Influence de la configuration d’excitation - 126



4.4 Modification des couplages intermoléculaires - 127

4.4.1 Auto-extinction de la photoluminescence - 127

4.4.2 Transfert résonant d’énergie de Förster - 130



4.5 Conclusion - 135



5 Effet plasmonique sur un film métallique nanorugueux 137



5.1 Élaboration et caractérisation des films nanorugueux - 138

5.1.1 Structuration du film métallique - 138

5.1.2 Étude topographique des films nanostructurés - 138



5.2 Couplage avec les fluorophores - 143

5.2.1 Influence de la morphologie du film métallique - 143

5.2.2 Influence de la distance sur le couplage métal-fluorophore - 144



5.3 Conclusion - 146



6 Applications aux puces à ADN 149



6.1 Préparation des puces à ADN - 149

6.1.1 Démonstration de principe - 149

6.1.2 Mesure de l’épaisseur de la couche de polymère - 150



6.2 Amplification du signal de fluorescence - 151

6.2.1 Sur un film métallique plan - 152

6.2.2 Sur un film métallique nanostructuré - 153

6.2.3 Dispersion du signal de fluorescence - 155



6.3 Conclusion - 158



7 Applications à l’imagerie cellulaire et tissulaire 161



7.1 Imagerie de cellules épithéliales pour la cancérologie - 162

7.1.1 Images de fluorescence - 162

7.1.2 Étude statistique de l’exaltation du signal - 166

ix

7.1.3 Influence de l’ouverture numérique à la collection - 167

7.1.4 Limites du modèle - 168



7.2 Imagerie tissulaire pour le diagnostic médical - 169

7.2.1 Contexte biomédical, limites et besoins - 170

7.2.2 Conditions expérimentales - 170

7.2.3 Imagerie et analyse des échantillons - 171



7.3 Conclusion - 173

7.3.1 Avantages pour l’imagerie biomédicale - 173

7.3.2 Améliorations potentielles de la méthode - 173



8 Conclusion générale 175



Références 179

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