Tricoire, Ludovic (2006) La bioluminescence de l'aequorine en réponse au calcium in vitro et dans le cortex cérébral. PhD thesis Neurosciences, Université Pierre et Marie Curie (Paris VI), ESPCI p.185.

Full text available as: - Mémoire_these_Tricoire.pdf ( 9188 Kb )

Licence: Copyright

Abstract

During my PhD, I investigated in vitro the calcium-dependent bioluminescence of the

photoprotein aequorin and then used its bioluminescence to image neuronal activities in the

neocortical network. This genetically encoded calcium sensor can be expressed in specific

cell types and its bioluminescence is not toxic and exhibit a high signal/noise ratio.

I first search for mutations modifying aequorin bioluminescence, using a random

mutagenesis and in vitro evolution approach. I isolated mutants showing modified stability,

calcium sensitivity and/or luminescence kinetics. The study of these mutants disclosed

relationships between bioluminescence kinetics and calcium sensitivity of aequorin. These

results help to understand how calcium binding leads to photon emission by aequorin.

Next, I used the bioluminescence of a GFP-aequorin chimera expressed in

neocortical slices with the recombinant Sindbis virus to image the activities of neuronal

ensembles. Using this approach, I studied the cholinergic modulation of neocortical

responses to electrical stimulation. I showed that muscarinic agonists increase spatial extent

and the duration of neocortical network responses to electrical stimulations.

Table of content

LA BIOLUMINESCENCE DE L’AEQUORINE 2

1 INTRODUCTION 2

1.1 La biologie de la bioluminescence 2

1.1.1 Généralités sur la bioluminescence 2

1.1.2 Diversité des systèmes bioluminescents 6

1.1.3 Origine de la coelentérazine 13

1.2 La photoprotéine aequorine 15

1.1.1 Préparation de l’aequorine 15

1.1.2 Bioluminescence de l’aequorine indépendante du calcium 15

1.1.3 Activité luciférase de l’aequorine 16

1.1.4 Structure de l’aequorine 18

1.3 Le domaine de liaison du calcium Dans l’aequorine : l’EF-hand 23

1.3.1 Structure d’un domaine EF-hand 23

1.3.2 Affinité pour le calcium 26

1.3.3 Bioluminescence de l’aequorine dépendante du calcium 26

1.4 Mécanisme de la bioluminescence 28

1.4.1 De la liaison du calcium à l’émission de lumière 28

1.4.2 La chimie de la bioluminescence. Les espèces émettrices 30

1.4.3 L’émission de lumière par le coelentéramide 32

1.4.4 Transfert d’énergie de biolumnescence par resonance (BRET) 34

2. RESULTATS : ETUDE DE L’AEQUORINE PAR MUTAGENESE ALEATOIRE ET CRIBLAGE FONCTIONNEL 36

2.1 Présentation de l’article 1 : “Thermostable mutants of the photoprotéin aequorin obtained by in vitro evolution” 37

2.1.1 Sélection des mutants Bright et SloDK 37

2.1.2 Thermostabilité 37

2.1.3 Déclenchement de la bioluminescence par liaison du Ca2+à l’EF3 38

Article 1 : Thermostable mutants of the photoprotéine aequorin obtained by in vitro evolution 39

2.2 Présentation de l’article 2 : “Calcium dépendence of aequorine bioluminescence dissected by random mutagenesis” 40

2.2.1 Sensibilité calcique 40

2.2.2 Cinétique de la luminescence et quantité totale de photon 41

2.2.3 Rôle des résidus Gln168 et Leu170 dans la cinétique de bioluminescence 42

2.2.4 Dépendance au calcium de la bioluminescence de l’aequorine : un modèle 42

Article 2 : « Calcium dépendance of aequorine bioluminescence dissected by random mutagenesis » et informations supplementaires 44

2.3 Remarques générales 45

IMAGERIE DES ACTIVITES NEURONALES PAR BIOLUMINESCENCE AEQUORINE 47

1. INTRODUCTION 47

1.1 Utilisation de l’aequorine comme senseur calcique 47

1.1.1 Historique 47

1.1.2 La protéine de fusion GFP-aequorine 50

1.1.4 Avantages et inconvenients 50

1.2 Modulation cholinergique dans le néocortex 51

1.2.1 Architecture du réseau néocortical 51

1.2.2 L es connexions intracorticales et entrées-sorties 63

1.2.3. acetylcholine dans le réseau néocortical. 71

2. MATERIELS ET METHODES 82

Préparation de pseudovirion sindbis recombinant. 82

Préparation des tranches néocorticales 84

Enregistrement de la bioluminescence 84

Enregistrements électrophysiologiques 85

Analyse des données de bioluminescence 86

Histochimie 87

3. RESUTATS : ETUDE DE LA MODULATION CHOLINERGIQUE DANS LE NEOCORTEX PAR IMAGERIE DE BIOLUMINESCENCE AEQUROINE 89

Caractérisation des réponses bioluminescentes en tranches de néocortex 89

Expression de GA 89

Réponses à la stimulation d’un seul neurone 93

Réponses à l’application de glutamate 95

Intégrité du réseau excitateur 95

Intégrité du réseau inhibiteur 98

Réponses du réseau aux stimulations électriques 100

Modulation cholinergique du réseau néocortical 104

Les agonistes muscariniques augmentent l’amplitude et la durée des réponses évoquées 104

Augmentation d’amplitude des réponses évoquées 108

Activités persistantes en couche V 111

Correspondance avec l’activité électrophysiologique 114

4. DISCUSSION 119

Imagerie de bioluminescence aequorine 119

Les effets muscariniques sur l’extension spatiale 120

Les effets muscariniques sur la durée 121

L’acétylcholine a-t-elle un effet biphasique inhibiteur/excitateur sur réseau cortical ? 123

ANNEXE 124

REFERENCES 129

Statistiques de consultation

Repository Staff Only: edit this item