Andre, Franck (2006) In vivo Gene electrotransfer: optimisation and mechanisms. PhD thesis Biologie Medecine et Santé, CNRS UMR 8121 Institut Gustave Roussy: Vectorologie et transfert de gènes, INAPG 2006INAP0027.

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Abstract

DNA electrotransfer is a promising solution to the problems induced by the use of

viral transfer techniques, both in terms of therapeutic applications and as a tool for research.

However, improvements have to be made concerning the transfection efficacy in the different

cell lines, the knowledge of the underlying mechanisms and also the knowledge of the safety

of the electrotransfer.

In a preliminary study we have proved that transfection efficacy for DNA injection alone

increased with the speed of injection, mainly due to receptor mediated endocytosis, but also

partly to membrane permeabilisation.

Afterward we have confirmed in vivo the permeabilising role of the short high voltage pulses

(HVs) and the electrophoretic role of the long low voltage pulses (LVs), during the

elctrotransfer. We have also shown the influence of a delay between the HV and the LV, on

the efficacy and the toxicity of the pulses applied. Our study of the HV also tends to indicate

that the tissue doesn’t have to be entirely permeabilised to obtain a good electrotransfer. We

have also confirmed in vivo that the smaller the cells are, the higher the voltage applied for the

HV has to be. This is in agreement with Schwan’s formula: ΔΨi = F.g(λ).r.E.cosθ, where “r”

stands for the cell’s radius.

At last, we have shown that there are no lesions or cellular stress induced by the optimal set of

HV+LV used, especially when the LV pulse is split in 8 pulses.

Table of content

ABREVIATIONS UTILISEES : - 6

AVANT PROPOS - 8

INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE - 9

I. INTRODUCTION A LA THERAPIE GENIQUE - 9

A. PROTEOTHERAPIE ET THERAPIE GENIQUE - 10

B. DIVERSES APPROCHES DE LA THERAPIE GENIQUE - 10

C. APPLICATIONS CLINIQUES DE LA THERAPIE GENIQUE - 11

II. LES DIVERS ACIDES NUCLEIQUES TRANSFECTES DANS LE CADRE

DES THERAPIES GENIQUES - 12

A. LES ACIDES NUCLEIQUES UTILISES DANS LE CADRE DE LA REGULATION TEMPORELLE DE

L'EXPRESSION DES GENES - 13

1. Stratégies anti-gène : ciblage direct du gène d'intérêt - 14

2. Stratégies anti-ARNm - 15

a) ARNm antisens codé par un vecteur : - 15

b) Oligodésoxynucléotides antisens (ODN) : - 16

c) ARNi (ou ARN interférence) : - 17

d) Ribozyme : - 19

e) DNAzyme : - 20

f) Aptamères : - 20

g) Points clés intervenant dans l’efficacité d’un antisens : - 21

B. LES SEQUENCES CODANTES D’ADN - 21

III. LES ETAPES DU TRANSFERT D’ACIDES NUCLEIQUES - 22

A. AMENER LES ACIDES NUCLEIQUES A PROXIMITE DE LA CELLULE CIBLE - 23

1. Injection locale - 23

2. Injection intraveineuse - 24

3. Autres voies d’administration - 25

4. La matrice extracellulaire : une barrière à l’apport des acides nucléiques au

contact des cellules cibles - 26

5. La magnétofection : une technique pour concentrer les acides nucléiques au niveau

des cellules cibles - 29

B. PASSAGE DE LA MEMBRANE CELLULAIRE - 29

1. Barrière physique - 30

2. Barrière électrostatique - 31

3. Une possibilité de passage naturel de la membrane par les acides nucléiques ? ... 31

C. TRANSPORT ET DEGRADATION INTRACELLULAIRE - 33

1. Transport - 33

2. Dégradations - 33

3. Piégeage dans des compartiments - 34

D. PASSAGE DE L’ENVELOPPE NUCLEAIRE - 34

E. CONTROLE DE L’ACTION DU TRANSGENE - 37

1. Contrôle de l'initiation de la transcription du transgène : développement de

systèmes inductibles - 38

a) Exigences d'un bon système inductible - 38

1

Table des matières

b) Systèmes régulables par la tétracycline - 39

c) Systèmes basés sur des récepteurs aux hormones stéroïdes - 42

2. Durée d’expression - 43

a) Origines de la perte d’expression - 43

b) Augmentation de la durée d’expression - 44

3. Effets indésirables de l’acide nucléique dus à des réactions immunitaires contre la

protéine exprimée ou l’ADN - 46

a) Réaction immunitaire contre l’ADN : les motifs CpG non méthylés - 46

b) Réaction immunitaire contre la protéine exogène - 48

IV. LES DIFFERENTES METHODES DE TRANSFERT - 48

A. LES METHODES VIRALES - 49

1. Rétrovirus - 52

2. Lentivirus - 52

3. Adénovirus - 53

4. Les virus associés aux adénovirus (AAV) - 54

5. Herpes virus simplex (HSV) - 55

B. LES METHODES PHYSICO-CHIMIQUES - 55

1. ADN nu - 56

2. Les vecteurs synthétiques - 57

a) Polymères cationiques - 58

b) Dendrimères - 60

c) Lipides cationiques - 61

3. Les méthodes physiques - 64

a) Micro-injection - 64

b) Injection locale : « jet injection » - 65

c) Injection intraveineuse : la méthode hydrodynamique - 65

d) Le canon à ADN : le gene gun - 67

e) Ultrasons : la sonoporation - 68

f) Laser - 68

g) Champ magnétique - 69

h) Electrotransfert - 69

C. L’APPROCHE EX VIVO : LES VECTEURS CELLULAIRES - 69

1. Vecteurs cellulaires utilisés pour la production de protéines - 70

2. Vecteurs cellulaires utilisant les spécificités d’un type de cellules données - 70

V. L’ELECTROTRANSFERT - 71

A. HISTORIQUE - 71

B. ASPECTS PHYSICO-CHIMIQUES GENERAUX CONSECUTIFS A L’APPLICATION D’UN CHAMP

ELECTRIQUE A DES CELLULES - 73

1. Notion de circuit électrique équivalent - 73

2. Effets physico-chimiques de l’application d’un champ électrique - 73

a) Effets scalaires - 73

(1) Effet Joule - 73

(2) Effets électrochimiques au niveau des électrodes - 74

b) Effets vectoriels - 74

(1) Effets à l'échelle de la cellule - 74

(a) Orientation cellulaire - 74

(b) Déformation des cellules - 74

(c) Électrophorèse globale des cellules - 74

(d) Diélectrophorèse cellulaire - 75

(2) Effets à l'échelle moléculaire - 75

2

Table des matières

(a) Electrophorèse et orientation des composants membranaires - 75

(b) Potentiel membranaire induit par le champ électrique - 75

C. ELECTROPERMEABILISATION - 76

1. Notion de seuil de perméabilisation membranaire - 76

2. Asymétrie de la perméabilisation membranaire - 77

3. Notion de réversibilité de la perméabilisation ou « resealing » - 78

4. Répercussions cellulaires de l’électroperméabilisation - 78

5. Modèles mécanistiques de l’électroperméabilisation - 79

a) Modèle expliquant la rupture irréversible de la membrane - 79

b) Electroporation ou la formation de pores : la théorie initiale - 79

(1) Modèles - 79

(2) Mise en évidence des pores ? - 80

c) Modèle actuel - 81

6. Applications de l’électroperméabilisation - 82

a) Électroperméabilisation et électrochargement - 82

b) Electrofusion - 83

c) Électroinsertion - 83

d) Electromortalité - 83

D. ASPECTS MECANISTIQUES DE L’ELECTROTRANSFERT - 84

1. Importance d’une composante électrophorétique lors de l’électrotransfert - 84

2. Une internalisation de l’ADN postérieure à l’impulsion électrique - 86

3. Implication du métabolisme énergétique dans l’électrotransfert - 86

4. Modèles mécanistiques de l’électrotransfert - 86

E. ASPECTS PRATIQUES DE L’ELECTROTRANSFERT - 88

1. Les différents paramètres électriques de l’électrotransfert - 88

a) Les générateurs d’impulsions - 88

b) Les électrodes - 89

c) Le champ électrique - 91

d) La forme des impulsions électriques - 92

e) La durée et le nombre d’impulsions électriques - 93

f) La fréquence - 94

2. Les autres paramètres influençant l’électrotransfert - 95

a) Composition du milieu - 95

(1) In vitro - 95

(2) In vivo - 96

b) Température - 97

c) Taille et concentration du plasmide - 97

d) Répercussions cellulaires et moléculaires de l’électrotransfert - 98

(1) In vitro - 98

(2) In vivo - 99

e) Tissus et cellules cibles - 100

F. APPLICATIONS DE L’ELECTROTRANSFERT - 102

1. Applications thérapeutiques - 102

a) Sécrétion ectopique de protéines - 102

b) Maladies nécessitant la production intracellulaire d’une protéine - 103

c) Vaccination par immunisation génétique - 104

d) Traitement des Cancers - 105

2. Outil d’investigation - 106

a) Etude de la régulation de l’expression d’un gène d’intérêt - 106

b) Etude de la fonction d’un gène/d’une protéine - 107

RESULTATS - 109

3

Table des matières

I. INFLUENCE DE L’INJECTION SUR L‘ELECTROTRANSFERT - 109

A. PROBLEMATIQUE DE LA DISTRIBUTION DU VOLUME INJECTE - 110

1. Cas du muscle tibialis cranialis - 110

2. Cas des tumeurs sous cutanées - 113

3. Cas du foie - 115

B. INFLUENCE DE LA VITESSE D’INJECTION (ARTICLE 1) - 117

II. ETUDE DES ALTERATIONS INDUITES PAR L’ELECTROTRANSFERT. 145

A. LESIONS HISTOLOGIQUES - 145

B. INDUCTION DE L’EXPRESSION DE PROTEINES DE STRESS (HSP) - 146

III. ETUDE DES PARAMETRES ELECTRIQUES - 150

A. ROLES DES IMPULSIONS HV ET LV DANS LE MUSCLE (ARTICLE 2) - 151

B. ETUDE DE L’IMPULSION PERMEABILISANTE (HV) DANS DIVERS TISSUS - 160

1. Muscle - 160

a) Importance de la température de récupération de l’échantillon - 160

b) Influence du voltage de l'impulsion perméabilisante - 161

c) Effet d’un délai entre le HV et le LV - 161

2. Tumeur - 163

a) Intérêt du mélanome B16 comme modèle pour l’étude de l’électrotransfert de

tumeur - 163

b) Influence du voltage de l'impulsion perméabilisante - 164

c) Effet d’un délai entre le HV et le LV - 165

d) Influence du voltage de l'impulsion électrophorétique - 166

3. Foie - 167

a) Intérêt de l’injection systémique par rapport à l’injection locale dans le cas de

l’électrotransfert dans le foie - 167

b) Influence du voltage du HV et du LV appliqués - 168

C. NECESSITE D’UN CONTROLE ET D’UN AJUSTEMENT EN TEMPS REEL DES PARAMETRES

ELECTRIQUES, DANS LE CADRE DE FUTURES APPLICATIONS CLINIQUES. (MANUSCRIT 1) - 171

DISCUSSION/CONCLUSIONS - 187

I. NECESSITE DE CONTROLER LA VITESSE ET LA DISTRIBUTION DE

L’INJECTION - 187

A. IMPORTANCE DE LA DISTRIBUTION DU LIQUIDE INJECTE - 187

B. IMPORTANCE DE LA VITESSE D’INJECTION - 187

II. DIVERS EFFETS DES IMPULSIONS ELECTRIQUES - 188

A. CONFIRMATION IN VIVO DES ROLES PERMEABILISANTS ET ELECTROPHORETIQUES DES

IMPULSIONS - 188

B. EFFET D’UNE AUGMENTATION DU VOLTAGE DE L’IMPULSION HV - 189

C. EFFET DE LA TAILLE DES CELLULES - 189

D. EFFET D’UNE AUGMENTATION DU VOLTAGE DE L’IMPULSION LV - 189

E. EFFET D’UN DELAI D’UNE SECONDE ENTRE LE HV ET LE LV - 190

III. CONTROLE EN TEMPS REEL DU VOLTAGE DE L’IMPULSION

PERMEABILISANTE POUR DE FUTURES APPLICATIONS CLINIQUES - 190

IV. PERSPECTIVES - 190

MATERIELS ET METHODES - 192

4

Table des matières

I. PRODUCTION DES VECTEURS PLASMIDIQUES - 193

A. VECTEURS PLASMIDIQUES - 193

B. TRANSFORMATION DES BACTERIES - 194

1. Génotype et caractéristiques des souches d'E. coli - 194

2. Milieux de culture - 194

3. Préparation de bactéries électrocompétentes - 194

4. Transformation de bactéries électrocompétentes par électroporation - 195

5. Vérification du plasmide transfecté dans les bactéries - 196

a) Miniprep d’ADN (Qiagen) - 196

b) Coupure par des enzymes de restriction - 196

c) Electrophorèse d’ADN - 196

6. Préparation de stocks de bactéries transformées - 197

C. PRODUCTION DU PLASMIDE : GIGAPREP ENDOTOXIN FREE - 197

1. Quantification de l’ARN et de l’ADN - 197

II. EXPERIMENTATION ANIMALE - 197

A. ANIMAUX - 197

B. ANESTHESIE - 197

C. TRANSFERT DE GENES IN VIVO DANS LE MUSCLE SQUELETTIQUE DE SOURIS - 198

1. Rasage : - 198

2. Injection de plasmides : - 198

3. Coinjection avec de la hyaluronidase ou de l’héparine : - 198

4. Electrotransfert : - 198

D. TRANSFERT DE GENE IN VIVO DANS UNE TUMEUR SOUS CUTANEE DANS LA SOURIS - 198

1. Culture cellulaire : - 198

2. Inoculation des tumeurs sous cutanées : - 198

3. Rasage : - 199

4. Injection de plasmides : - 199

5. Electrotransfert : - 199

E. TRANSFERT DE GENE IN VIVO DANS LE FOIE DE LA SOURIS - 199

1. Laparotomie - 199

2. Injection de plasmides : - 199

3. Electrotransfert : - 199

F. OBSERVATIONS A LA LOUPE BINOCULAIRE AVEC OU SANS FLUORESCENCE - 200

1. Préparation de l’animal - 200

2. Optique - 200

G. PRELEVEMENTS - 200

1. Prélèvements des tissus chez la souris - 200

2. Prélèvements de sang - 200

H. HISTOLOGIE - 200

I. DOSAGE DE L'ACTIVITE LUCIFERASE - 201

J. PROTOCOLE DE QUANTIFICATION DE L’EXPRESSION DE HSP70 - 201

1. Extraction d’ARN - 201

2. Transcription inverse (RT) - 202

3. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) - 202

K. STATISTIQUES - 203

REFERENCES - 204

ANNEXES - 228

Statistiques de consultation

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