Thevenieau, France (2006) Ingenierie metabolique de la levure yarrowia lipolytica pour la production d’acides dicarboxyliques a partir d’huiles vegetales. PhD thesis Biotechnologie, INAPG 2006INAP0022.
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Abstract
Les acides dicarboxyliques (DCA) sont des composés de base pour la production de polymères,plastiques, lubrifiants, antibiotiques et parfums. Bien que de grand intérêt, les DCA qui comportent une chaîne aliphatique supérieure à douze atomes de carbone sont difficilement synthétisables par la voie chimique. L’objet de cette étude est de développer un procédé biotechnologique pour produire ces composés par bioconversion de matières premières renouvelables (huile de tournesol oléique) via la levure Yarrowia lipolytica.
Chez les souches sauvages, les acides gras sont principalement dégradés par la voie de la beta-oxydation.
Nous avons bloqué la première étape de la beta-oxydation par disruption séquentielle des six gènes codant les isozymes d’acyl-CoA oxydases (gènes POX) permettant ainsi de réorienter le flux d’acides gras vers une voie alternative, l’omega-oxydation, qui conduit à la production de DCA. L’amélioration de la production des DCA a été obtenue par l’augmentation de l’activité d’hydroxylation, impliquée dans la première étape de l’omega-oxydation, en surexprimant les gènes codant la NADPH cytochrome P450 réductase (1 gène CPR) et des cytochromes P450 (12 gènes ALK). Ainsi, la surexpression du gène CPR améliore la production de DCA de 60%. De plus, l’effet de la surexpression de gènes ALK suggère une spécificité fonctionnelle de certains cytochromes P450 vis-à-vis de la longueur de chaîne et du type de substrat (alcanes ou acides gras).
Néanmoins, la moitié du substrat de bioconversion n’est pas transformé en DCA, mais s'accumule dans les corps lipidiques sous forme de triglycérides. Ce stockage a été réduit par la disruption de deux gènes, DGA1 et LRO1, impliqués dans cette voie, permettant ainsi une augmentation du rendement de bioconversion.
Enfin, l’étude de mutants d’insertion affectés pour l’utilisation des substrats hydrophobes (substrats de
bioconversion) a révélé l’implication d’ABC transporteurs de la famille des PDR qui confèrent la résistance pléiotropique aux drogues (5 gènes ABC). L’étude fonctionnelle de cette famille a démontré que l’ABC transporteur codé par le gène ABC1 serait un exporteur membranaire spécifique des alcanes à longue chaîne carbonée. Il constitue, à ce jour, le premier ABC transporteur de type PDR identifié comme étant responsable de l’export de molécules physiologiques.
L’ensemble de ces travaux a permis d’une part une meilleure compréhension du métabolisme des substrats hydrophobes et d’autre part de développer une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica pour la production de DCA à longue chaîne carbonée à partir d’huiles végétales.
| Item Type: | PhD Thesis (PhD) |
|---|---|
| Thesis Supervisor: | Nicaud, Jean-Marc |
| Date: | December 2006 |
| Board of examiners: | Gaillardin, Claude and Goffeau, André and Aigle, Michel and Pignède, Georges and Marchal, Rémy and Nicaud, Jean-Marc |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biotechnologie |
| Collection (Fonds): | INAPG |
| Institution: | INAPG |
| Subjects: | 7. Life Sciences and Engineering |
| Uncontrolled Keywords: | Yarrowia lipolytica, Acides dicarboxyliques, Polymères, Métabolisme des acides gras, Beta-oxydation, Omega-oxydation, ABC transporteur. |
Table of content
Chapitre I - INTRODUCTION 3
A. Les acides dicarboxyliques 3
A.1. Intérêts industriels des acides dicarboxyliques 3
A.2. Production d’acides dicarboxyliques par synthèse chimique 5
A.3. Production d’acides dicarboxyliques par voie biotechnologique 5
A.4. Substrats de bioconversion 6
A.5. Applications des acides dicarboxyliques à longue chaîne carbonée 6
B. Yarrowia lipolytica 8
B.1. Taxonomie 8
B.2. Caractéristiques physiologiques 8
B.3. Caractéristiques génomiques 9
B.4. Outils génétiques 10
B.4.1. Les souches de Yarrowia lipolytica 10
B.4.2. Les marqueurs de sélection 11
B.4.3. Les promoteurs 11
B.4.4. Les séquences de sécrétion 12
B.4.5. Les systèmes d’amplification 13
B.4.6. Le système Cre lox recombinase 14
B.5. Collections de mutants 15
B.6. Applications industrielles de Yarrowia lipolytica 16
B.6.1. Sécrétion de protéines 16
B.6.2. Bioconversion 17
B.6.3. Production de métabolites intermédiaires 17
C. Transport des substrats hydrophobes 18
C.1. Hydrolyse des triglycérides 18
C.2. Interaction cellules/substrat 18
C.3. Transport et activation des acides gras 20
C.4. Transport via les ABC transporteurs et peroxysomes 24
C.4.1. Architecture moléculaire des protéines ABC chez les levures 26
C.4.2. Fonctions des ABC transporteurs chez Saccharomyces cerevisiae 27
C.4.3. Distribution cellulaire des ABC transporteurs 28
C.4.4. Régulation de l’expression des gènes ABC chez Saccharomyces cerevisiae 38
C.4.5. Le rôle physiologique des protéines ABC chez Saccharomyces cerevisiae 40
D. Métabolisme des substrats hydrophobes chez les levures 41
D.1. Oxydation monoterminale des alcanes et voie de l’ω-oxydation 43
D.1.1. Première étape de l’oxydation monoterminale et de l’ω-oxydation 44
D.1.2. Deuxième étape de l’oxydation monoterminale et de l’ω-oxydation 48
D.1.3. Troisième étape de l’oxydation monoterminale et de l’ω-oxydation 49
D.2. Oxydation des acides gras 50
D.2.1. Oxydation des acides gras saturés 51
D.2.2. Oxydation des acides gras insaturés 53
D.3. Induction de l’expression de gènes par les acides gras 55
D.3.1. Régulation via des éléments de réponse oléate 56
D.4. Biosynthèse d’acides gras 57
D.4.1. Biosynthèse d’acides gras saturés 59
D.4.2. Désaturation des acides gras 60
D.4.3. Elongation des acides gras 61
D.5. Accumulation des lipides dans les corps lipidiques 62
E. Production d’acides dicarboxyliques par les levures 67
Chapitre II - MATERIEL ET METHODES 70
A. Matériel 70
A.1. Souches 70
A.2. Vecteurs 70
A.2.1. Plasmides 70
A.2.2. Vecteurs d’expression 71
A.3. Milieux de culture 74
A.3.1. Milieux de culture complet pour Escherichia coli 74
A.3.2. Milieux de sélection des transformants d’Escherichia coli 74
A.3.3. Milieux de culture pour Yarrowia lipolytica 74
A.3.4. Milieux de sélection des transformants de Yarrowia lipolytica 75
A.3.5. Milieux utilisés lors des tests en gouttes 75
A.3.6. Milieux de production des acides dicarboxyliques 76
A.4. Fermentation 77
A.4.1. Matériel 77
A.4.2. Conditions de production 79
B. Méthodes 79
B.1. Techniques de préparation des acides nucléiques 79
B.1.1. Méthodes de préparation de l’ADN 79
B.1.2. Amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) 80
B.1.3. Purification de fragments d’ADN 81
B.2. Technique d’analyses des acides nucléiques 81
B.2.1. Hydrolyse par des endonucléases de restriction 81
B.2.2. Déphosphorylation de l’ADN 81
B.2.3. Ligature de l’ADN 82
B.2.4. Analyse par séparation électrophorétique 82
B.3. Techniques de transformation 82
B.3.1. Transformation d’Escherichia coli 82
B.3.2. Transformation de la levure Yarrowia lipolytica 83
B.4. Construction de souches disruptées 84
B.4.1. Construction des cassettes de disruption 84
B.4.2. Expression de la recombinase Cre et marqueur d’excision 86
B.4.3. Vérification de la disruption et de l’excision 86
B.4.4. Hybridation des acides nucléiques 86
B.5. Assimilation d’alcanes radioactifs 87
B.6. Localisation cellulaire des protéines par immunofluorescence 88
B.7. Techniques analytiques 89
B.7.1. Dosage du glucose résiduel 89
B.7.2. Dosage des acides dicarboxyliques 89
B.7.3. Estimation de la biomasse 91
B.7.4. Données de fermentation 92
Chapitre III - RESULTATS ET DISCUSSION 93
A. Blocage de la voie de la β-oxydation 94
A.1. Méthodes de dosage des acides dicarboxyliques 94
A.2. Procédé de production des acides dicarboxyliques 94
A.2.1. Influence du substrat de bioconversion 96
A.2.2. Influence de la composition du milieu de culture 96
A.2.3. Production en fermenteur sur milieu riche 99
A.2.4. Influence du cosubstrat énergétique 100
A.3. Construction et analyse de mutants de la voie de la β-oxydation 112
A.3.1. Analyse génomique des gènes POX 112
A.3.2. Construction d’une souche génétiquement manipulable 116
A.3.3. Construction de mutants de la voie de la β-oxydation 117
A.3.4. Essais de production d’acides dicarboxyliques 118
A.3.5. Construction d’un mutant Δpox 118
A.3.6. Tests de production d’acides dicarboxyliques 119
A.4. Origine des acides dicarboxyliques 120
A.5. Blocage de la voie de la β-oxydation : Bilan 124
B. Surexpression de la voie de l’ω-oxydation 126
B.1. Analyse phylogénétique des cytochromes P450 126
B.2. Effet de la surexpression du gène CPR 130
B.2.1. Construction des vecteurs d’expression et des mutants 130
B.2.2. Tests de production d’acides dicarboxyliques 130
B.3. Effet de la surexpression des gènes ALK 136
B.3.1. Construction des vecteurs d’expression et des mutants 136
B.3.2. Tests de production d’acides dicarboxyliques 137
B.3.3. Surexpression du système P450 : Bilan 139
C. Identification de facteurs limitants la production de DCA 142
C.1. Influence du cosubstrat et de l’apport d’azote 143
C.2. Etude fonctionnelle des gènes impliqués dans le stockage des lipides 145
C.2.1. Construction des mutants 146
C.2.2. Test de production d’acides dicarboxyliques 147
D. Identification et étude fonctionnelle d’une famille d’ABC transporteur 149
D.1. Localisation des DCA produits 149
D.2. Collection de mutants 150
D.2.1. ANT1 est requis pour l’utilisation des alcanes à chaîne courte 151
D.2.2. ABC1 est requis pour l’utilisation des alcanes à chaîne longue 152
D.3. Analyse génomique d’une famille d’ABC transporteur 153
D.4. Analyse phénotypique d’une famille d’ABC transporteur 166
D.4.1. Construction des souches mono et multidisruptées 166
D.4.2. Phénotypes de croissance 166
D.4.3. Bilan 170
D.5. Fonction du transporteur Abc1p 171
D.6. Localisation du transporteur Abc1p 174
D.7. Sensibilité aux azoles 176
D.8. Bilan 178
Chapitre IV - CONCLUSION ET PERSPECTIVES 179
| ID Code: | 2515 |
|---|---|
| Deposited By: | France Thevenieau |
| Deposited On: | 18 June 2007 |
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