Quinton, Loïc (2006) Characterization of peptidic toxins by high resolution mass spectrometry. PhD thesis DCMR, EP - DCMR Laboratoire des Mécanismes Réactionnels, EP/X p.265.

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Abstract

PARMI LES DIFFERENTES SOURCES NATURELLES DE COMPOSES BIOLOGIQUEMENT ACTIFS, LES VENINS REPRESENTENT, DE PAR LA GRANDE VARIETE DE LEURS CONSTITUANTS, UNE CIBLE DE CHOIX POUR LA RECHERCHE MEDICALE. LES TOXINES QU’ILS CONTIENNENT SONT VARIEES ET COMPRENDRE LEUR MODE D’ACTION DANS LE BUT DE SYNTHETISER DES ANALOGUES D’INTERET PHARMACOLOGIQUE PASSE PAR UNE DETERMINATION PRECISE DE LEUR STRUCTURE CHIMIQUE AVEC LA CONTRAINTE QUE LA FAIBLE QUANTITE DE MATERIEL GENERALEMENT DISPONIBLE REND L’ENSEMBLE DES PROCESSUS DE SEPARATION ET DE CARACTERISATION TRES DELICAT. C’EST DANS CE CONTEXTE QUE SE SITUE CETTE THESE DONT L’OBJECTIF A ETE DE METTRE AU POINT DE NOUVELLES STRATEGIES D’ANALYSE PAR SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION DE NOUVELLES TOXINES PEPTIDIQUES. CETTE THESE A PARTICULIEREMENT CIBLE L’ETUDE DE TOXINES PEPTIDIQUES DE CONES (MOLLUSQUES UTILISANT UN HARPON VENIMEUX POUR ATTEINDRE ET PARALYSE!
R LEUR PROIE) ET DE SERPENTS. AU FINAL, LA SPECTROMETRIE DE MASSE A HAUTE RESOLUTION S’EST REVELEE COMME UN OUTIL TRES PUISSANT POUR LA CARACTERISATION DE PETITES TOXINES MODIFIEES PAR SES GRANDES CAPACITES EN TERMES DE PRECISION SUR LA MESURE DE MASSE MAIS AUSSI DANS L’ETUDE DE PLUS GROSSES TOXINES POUR LESQUELLES LA RECENTE TECHNIQUE DE DISSOCIATION PAR CAPTURE D’ELECTRON S’EST MONTREE DES PLUS PERFORMANTES.

Table of content

Introduction - 1
Introduction Générale: Spectrométrie de masse et venins - 7
I. La spectrométrie de masse - 9
A. Aspects Généraux et Historique - 9
B. Les sources d'ionisation adaptées aux biomolécules - 13
B.1. L'electrospray - 13
B.2. Une miniaturisation de l’electrospray, le nano-electrospray - 17
B.3. Principes du MALDI - 18
C. La spectrométrie de masse FT-ICR - 20
C.1. La cellule ICR - 21
C.2. Le piégeage des ions - 22
C.3. Obtention d’un spectre de masse - 24
C.4. Performances de la spectrométrie de masse FT-ICR - 27
C.5. Nouveaux spectromètres hybrides qFT-ICR et LIT-FT-ICR - 29
C.6. Applications de la spectrométrie de masse FT-ICR - 30
D. La spectrométrie de masse en tandem: application au séquençage de peptides et de protéines - 30
D.1. Aspects généraux de la fragmentation - 30
D.2. La fragmentation de peptides - 33
D.2.a. Modèle du proton mobile - 33
D.2.b. Sites de protonation - 34
D.2.c. Fragmentation des peptides et mécanismes de formation des ions - 34
D.3. Apport de la spectrométrie de masse FT-ICR au séquençage de novo 38
D.3.a. Fragmentation par SORI-CAD - 38
D.3.b. La capture d’électron dissociative (ECD) - 40
D.3.c. Autres techniques de dissociation par FT-ICR - 42
II. Les venins: une source de composés biologiquement actifs - 48
A. Toxines et venins - 48
A.1. Les venins de serpents - 50
A.1.a. Généralités - 50
A.1.b. Composition des venins de serpent - 50
A.1.c. Applications liées à l’utilisation de toxines de serpent - 53
A.2. Les venins de cônes marins - 56
A.2.a. Cônes marins et mode d’envenimation - 56
A.2.b. Conopeptides et conotoxines - 59
A.2.c. Développement de nouveaux ligands et de nouveaux médicaments à partir des venins de cônes marins - 61
B. Stratégies classiques d’analyse des venins - 66
B.1. Cartographie d’un venin brut - 66
B.2. Recherche de toxines d’intérêts - 68
B.2.a. Recherche d’une activité biologique par des tests de liaison - 69
B.2.b. Apport du clonage moléculaire - 71
B.2.c. Rôle de la spectrométrie de masse - 72
Références Bibliographiques - 76
Chapitre I: Caractérisation de nouvelles sarafotoxines dans un venin brut de serpent par spectrométrie de masse FT-ICR et clonage moléculaire 83
I. Introduction - 85
II. Les sarafotoxines de serpents: des analogues structuraux et fonctionnels des endothélines des mammifères - 86
A. Découverte et historique des sarafotoxines - 86
B. Les endothélines des mammifères: rôle et mode d’action - 88
C. Comparaison sarafotoxines/endothélines - 89
C.1. Homologies structurales - 89
C.2. Organisation des précurseurs - 91
III. Cartographie du venin brut d’Atractaspis irregularis par FT-ICR - 95
A. Analyse du venin brut à l’état natif par nano-electrospray-FT-ICR 95
B. Analyse du venin brut après réduction des ponts disulfures - 98
IV. Recherche de sarafotoxines dans le venin - 101
A. Approche par clonage moléculaire - 101
A.1. Clonage de deux nouveaux précurseurs de sarafotoxines - 101
A.2. Comparaison des résultats du clonage et de nanoESI-FT-ICR - 103
B. Séquençage dans le venin brut - 105
B.1. Confirmation de séquence pour les sarafotoxines clonées - 105
B.2. Découverte d’une nouvelle famille de sarafotoxines - 109
C. Etude de la conformation tridimensionnelle de SRTX-i125
par RMN - 111
V. Conclusion et perspectives - 112
Références bibliographiques - 115
Chapitre II: Séquençage de novo de conotoxines par spectrométrie de masse – Apports d’un couplage chromatographique - 117
I. Introduction générale - 119
II. Séquençage de novo de conotoxines dans le venin brut de Conus virgo - 122
A. Analyse du venin brut de Conus virgo par nanoESI-FT-ICR - 122
A.1. Analyse du venin brut - 122
A.2. Analyse du venin réduit - 124
B. Séquençage de novo de deux nouvelles conotoxines - 125
B.1. Analyse des spectres MS/MS et séquençage de novo - 126
B.1.a. Etude générale des spectres de fragmentation - 126
B.1.b. Séquençage de la toxine m/z 1363,6038 - 128
B.1.c. Séquençage de la toxine m/z 1333,6038 - 130
B.2. Levée de l’ambiguïté Glu-Pro ou Pro-Glu - 131
C. Apports de l’approche par couplage en ligne - 133
C.1. Intérêt du couplage nanochromatographie/spectrométrie
de masse pour l’analyse de mélanges complexes - 134
C.2. Analyse du venin brut par nanoLC-FT-ICR - 135
C.3. Comparaison infusion directe/couplage pour le venin de
Conus virgo - 136
D. Conclusion - 137
III. Analyse du venin de Conus ermineus: comparaison de différentes approches - 138
A. Cartographie massique de Conus ermineus en infusion directe - 139
B. Approche par un couplage en ligne nanoLC-FT-ICR - 140
B.1. Analyse nanoLC-FT-ICR du venin avant réduction - 141
B.2. Analyse du venin réduit en nanoLC-FT-ICR - 143
C. Approche par un couplage hors ligne entre la chromatographie d’échange d’ions et la FT-ICR - 146
C.1. Séquençage de novo dans la fraction K - 148
C.2. Séquençage de novo dans la fraction D - 154
C.2.a. Approche par FT-ICR - 154
C.2.b. Approche par Q-TOF - 157
C.2.c. Activité biologique de l’a-conotoxine Er1D1772 - 160
C.3. Le venin de Conus ermineus, une richesse insoupçonnée… - 161
D. Conclusion - 163
IV. Conclusion générale - 166
Références Bibliographiques - 167
Chapitre III: Approches "bottom-up" et "top-down" par FT-ICR pour la caractérisation d’une nouvelle toxine spécifique des récepteurs a1A-adrénergiques - 169
I. Introduction - 171
II. Les mambas - 171
A. Généralités - 171
B. Composition des venins des mambas - 172
III. Stratégie utilisée pour caractériser de nouvelles activités dans le venin brut de Dendroaspis angusticeps - 174
A. Criblage des activités biologiques présentes dans du venin - 175
B. Analyse structurale d’une toxine active purifiée - 176
IV. L’AdTx1, une nouvelle toxine issue du venin Dendroaspis angusticeps ligand spécifique des récepteurs a1-adrénergiques - 176
A. Purification d’une toxine active sur les récepteurs a1-adrénergiques 177
B. Détermination de la séquence primaire de la toxine - 182
B.1. Mesure de masse précise et réduction des ponts disulfures - 182
B.2. Séquençage d’Edman - 184
B.3. Séquençage de l’extrémité C-terminale de DA1EOA par une approche "bottom-up" - 185
B.4. Approche "top-down" par ECD sur la toxine entière - 190
C. Recherche de la sélectivité de l’AdTx1 pour les sous-types du récepteur a1-adrénergique - 192
V. Caractérisation d’un homologue fluorescent de l’AdTx1 par FT-ICR - 195
A. Contexte général - 195
B. Caractérisation du mutant AdTx1 (K34R*) par une approche
"top-down" par ECD - 197
C. Transformation de l’AdTx1 en ligand fluorescent - 199
C.1. Contexte général et réactivité du Cy3B™ - 199
C.2. Localisation des sites modifiés par une approche "top-down" par dissociation en source (ISD) - 202
VI. Conclusion - 207
Références Bibliographiques - 210
Conclusion - 211
Annexes - 215
Annexe I: Partie instrumentale - 217
I. Le spectromètre de masse FT-ICR APEX III de Bruker - 217
II. La chaîne de nano-chomatographie liquide - 218
III. Interface nanoLC / spectromètre FT-ICR - 219
Annexe II: Partie expérimentale - 220
I. Analyse du venin d’Atractaspis irregularis par nanoESI-FT-ICR - 220
A. Analyse du venin brut par nanoESI - 220
B. Réduction des ponts S-S - 220
C Clonage des ARN messagers - 221
II. Analyse des venins de cônes marins - 221
A. Analyse du venin de Conus virgo - 221
B. Analyse du venin de Conus ermineus - 223
III. Analyse du venin de Dendroaspis angusticeps - 224
A. Analyse de la toxine naturelle DA1EOA - 224
B. Analyse de la toxine de synthèse AdTx1 - 225
Annexe III: Méthodes d’analyse biochimiques - 228
I. La dégradation d’Edman - 228
A. Principe et processus chimique de la technique - 228
B. Limitations de la technique - 229
II. Le clonage moléculaire - 230
A. De l’ADN à la synthèse des protéines chez les eucaryotes - 230
B. Principe du clonage moléculaire - 233
Références Bibliographiques - 237
Annexe IV: Publications scientifiques - 238

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