Grigoras, Ioana (2005) ''Contributions to the study of yeast detoxification by ABC-transporters: 1 - biochemical study of Yor1p; 2 - role of thiols in the toxicity of selenium.''. PhD thesis BIOC, EP - BIOC Laboratoire de Biochimie, EP/X p.194.

Alternative Locations: http://www.imprimerie.polytechnique.fr/Theses/Files/GRIGORAS.pdf

Abstract

The ABC-proteins form a large family of proteins present in all the living organisms. These proteins use the energy of ATP hydrolysis to transport a wide range of substances across biological membranes. In humans, some of these proteins have significant implications in pathology. For example, dysfunction of CFTR causes cystic fibrosis, and the overproduction of MRP1 is often associated with multidrug resistance phenomena. The yeast Saccharomyces cerevisiae has a cluster of 6 proteins (Y!
or1p, Ycf1p, Bpt1p, Ybt1p, Vmr1p, Nft1p) homologous to CFTR and MRP1. This family can thus serve as a model for the study of human proteins.
The first part of this work was a biochemical study of the yeast protein Yor1p. We added a histidine tag to the YOR1 gene and placed this construction under the control of a promoter allowing an overproduction in yeast. We showed that the histidine tagged Yor1p was produced in a functional form and, subsequently, we developed a method allowing the solubilization and the purification of Yor1p in a single step by metal affinity chromatography.
In a second part of this work, we produced in an isolated form in Escherichia coli the two NBD domains of Yor1p that are involved in ATP binding and hydrolysis and purified them to homogeneity. We studied ATP binding to these two domains, and were able to conclude that these domains are well structured. Thus, they can now be used for structural studies.
Finally, we considered the role of Ycf1p in selenite detoxification. We observed that the selenite toxicity for yeast was considerably increased in the presence of thiols. The formation of reactive oxygen species is probably at the origin of this hypertoxicity.

Table of content

Résumé - 1
Abstract - 2
Remerciements - 3
Sommaire - 5
Liste des figures - 9
Liste des tableaux - 14
Liste des abréviations - 15
Introduction - 17
Les protéines ABC - 17
Organisation générale des protéines ABC - 18
Motifs caractéristiques des protéines ABC - 20
Structure des protéines ABC - 22
Structure des domaines NBD - 24
Interactions entre les domaines NBD - 27
Structure des transporteurs ABC entiers - 31
Mécanisme d'action des transporteurs ABC - 40
Le fonctionnement des domaines NBD - 41
Le rôle des domaines TMD - 45
Mécanisme de couplage entre l’hydrolyse de l’ATP et le transport des substrats par les protéines ABC - 47
Intérêt de la levure comme organisme modèle pour l'étude des protéines ABC - 56
Chapitre I: Étude de la protéine Yor1p - 65
Expression fonctionnelle de Yor1p dans la levure Saccharomyces cerevisiae - 65
Le système d'expression - 65
Préparations d’extraits de membranes plasmiques - 67
Analyse fonctionnelle in vivo des souches produisant les protéines Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 - 68
Transport actif de la rhodamine B - 70
Analyse phénotypique des souches surproduisant la protéine Yor1p - 71
Purification des protéines Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 - 75
Solubilisation des protéines Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 par le n-dodécyl-ß-D-maltoside et purification de ces protéines par chromatographie d'affinité - 75
Caractérisation de la protéine Yor1p-(His)10 purifiée - 78
Activité ATPasique - 78
Analyse de l'état d'oligomérisation de la protéine Yor1p-(His)10 purifiée - 80
Essais d'amélioration de d'état de la protéine après la purification - 81
Solubilisation et purification en présence d'autres détergents - 81
Solubilisation et purification en présence des lipides - 83
Activité des protéines Yor1p, Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 dans des extraits de membranes plasmiques - 84
Marquage par le 8-azido-[a-32P]ATP - 84
Mesure de l'activité ATPasique - 86
Étude des mutants E1392Q et H1423R de la protéine Yor1p - 89
Caractérisation de l'activité ATPasique des protéines Yor1p, Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 dans des extraits de membranes plasmiques - 94
Effet des substrats sur l'activité des protéines Yor1p, Yor1p-(His)6 et Yor1p-(His)10 dans des extraits de membranes plasmiques - 95
Discussion - 98
Chapitre II: Étude des domaines NBD1 et NBD2 de Yor1p - 101
Production et purification des domaines NBD1 et NBD2 de Yor1p - 101
Définition de limites des domaines NBD - 101
Purification des domaines NBD - 104
Activité des domaines NBD1 et NBD2 de la protéine Yor1p - 105
Interaction avec des nucléotides - 105
Marquage par le 8-azido-[a-32P]ATP - 106
Interaction avec le TNP-ATP, un dérivé fluorescent de l’ATP - 107
Activité ATPasique et dimérisation des domaines NBD1 et NBD2 - 110
Discussion - 111
Chapitre III: Rôle des thiols dans la toxicité du sélénium - 115
Effet des thiols sur la toxicité du sélénite pour la levure - 117
Rôle de dérivés réactifs de l’oxygène (ROS) dans la toxicité du sélénite pour la levure - 120
Discussion - 124
Conclusion - 127
Matériels et méthodes - 131
Matériels - 131
Techniques générales de biochimie et de biologie moléculaire - 137
Constructions des souches de levure - 143
Clonage des domaines NBD de la protéine Yor1p dans le vecteur pET15blpa - 148
Autres méthodes utilisées - 149
Annexes - 163
Références bibliographiques - 173

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