THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PARIS VI

ECOLE DOCTORALE INTER///BIO

Spécialité

BIOCHIMIE

Présentée par

Béatrice MARQUEZ - GARRIDO

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS VI

Sujet de la thèse

Criblage antibactérien d’une Chimiothèque de molécules

Recherche d’inhibiteurs de deux systèmes d’efflux chez Staphylococcus aureus : les pompes NorA et Msr(A)

Soutenue le 28 septembre 2005

Devant le jury composé de :

Jean Delettré, Professeur à l’Université Paris VI	Président
Paul Tulkens, Professeur à l’Université Catholique de Louvain	Rapporteur
Jean-François Desnottes, Ex-Directeur de la Microbiologie d’Aventis	Rapporteur
Bernard Maigret, Directeur de Recherche CNRS, Nancy	Examinateur
Cécile Bébéar, Professeur à l’Université Bordeaux II	Co-directeur de thèse
Nicole Moreau, Professeur à l’ENSCP	Directeur de thèse

Remerciements

Ce travail de thèse a été réalisé au laboratoire de Biochimie de l’ENSCP (UMR CNRS 7573), dirigé par Madame le Professeur Nicole Moreau.

Je tiens à exprimer toute ma reconnaissance à Madame le Professeur Nicole Moreau qui m’a accueillie dans son laboratoire et m’a confié la mise en place de ce projet. Je la remercie chaleureusement pour l’encadrement de ce travail, son écoute et ses conseils tout au long de cette étude, et pour faire partie de ce jury de thèse.

J’adresse mes remerciements à Monsieur le Professeur Paul Tulkens pour être rapporteur de ce travail de thèse, et pour m’accueillir prochainement dans son laboratoire.

Je remercie également le Docteur Jean-François Desnottes d’avoir accepté d’être rapporteur de cette thèse.

Je remercie Monsieur le Professeur Jean Delettré, Monsieur le Docteur Bernard Maigret et Mademoiselle le Professeur Cécile Bébéar pour leur participation au jury de cette thèse.

Je remercie chaleureusement le Professeur Cécile Bébéar avec qui j’ai travaillé, notamment au début de ce projet, et qui m’a formée aux techniques de microbiologie. Son enthousiasme, sa bonne humeur et ses conseils judicieux ont créé une ambiance de travail instructive et agréable, et sa disponibilité et son écoute par la suite n’ont jamais fait défaut.

Je remercie vivement le Docteur Bernard Maigret qui m’a accueillie au sein de son laboratoire pour débuter la modélisation de la protéine Msr(A). Je lui sais gré du temps qu’il m’a consacré afin de m’initier aux différentes techniques de modélisation, de sa patience et des conseils avisés qu’il m’a prodigués.

Je remercie le Professeur Jean-Pierre Genêt qui m’a permis d’effectuer ma thèse au sein de l’UMR CNRS 7573 et Valérie Bardella pour son assistance administrative ; je salue l’ensemble du personnel de l’UMR qui a collaboré à la mise en place de la Chimiothèque.

Je tiens à remercier très chaleureusement Pascale Bouhours et Luc Neuville avec qui j’ai partagé le quotidien du laboratoire, qui m’ont aidée et supportée tout au long de ce travail de thèse et avec qui j’ai eu beaucoup de plaisir à travailler. Je remercie également les personnes qui ont collaboré à ce projet au laboratoire, Hervé, Clémence, Marielle et Sandrine, ainsi que les autres membres du laboratoire, présents ou passés, pour leur sympathie, Zaïna, Claude, Eliane, Marie, Soraya, Julien, Camille, Magali, Jean-Marc ainsi que nos voisins Katell, Béatrice, Nathalie, Mansour...

J’adresse tous mes remerciements aux membres du laboratoire de Bactériologie de Bordeaux pour leur aide et leur gentillesse, en particulier Sophie, Sabine, Hélène, Patrice, Alain, Philippe, Sébastien et aussi Maïté, Cathy, Charles, Christine, Brigitte.

Je tiens à remercier également les docteurs Christophe Chipot et Werner Treptow, ainsi que les autres membres de l’équipe eDAM à Nancy, qui m’ont aidée et ont contribué à créer une atmosphère de travail agréable.

Enfin je remercie les différentes équipes qui ont collaboré avec nous dans le cadre de la Chimiothèque Nationale.

Je remercie Monsieur Hugues Bienaymé et les sociétés Chrysalon et Urogène, ainsi que le CNRS, pour le soutien financier que j’ai reçu durant ma thèse. Je salue Pascaline, Audrey, Hélène, Christophe, Jacques, Didier, Karim et Rachid pour leur sympathie.

RESUME

Face à l’émergence de bactéries multi-résistantes aux antibiotiques, il est nécessaire de trouver de nouvelles molécules, actives contre les bactéries, ou qui inhibent leurs mécanismes de résistance et restaurent ainsi l’activité des antibiotiques existants.

Dans ce contexte, nous avons mis en place un système de criblage robotisé à moyen débit permettant d’étudier l’activité de molécules sur des bactéries en milieu liquide. Les composés testés sont des molécules synthétiques, provenant de la Chimiothèque Nationale du CNRS, et des extraits naturels de plantes. La collection de bactéries utilisée se compose de souches sensibles et de nombreuses souches résistantes. Dans le cadre de cette étude, nous nous sommes intéressés à la résistance par mécanisme d’efflux actif. Nous avons étudié en particulier deux systèmes d’efflux chez Staphylococcus aureus : la pompe NorA, qui confère une résistance multiple aux antibiotiques, dont les fluoroquinolones, et la pompe Msr(A), qui est spécifique des macrolides.

Un premier criblage sur les souches sensibles (Escherichia coli et S. aureus) permet de détecter des molécules ayant une activité antibactérienne. Pour celles-ci, une étude plus approfondie est menée. Les molécules dépourvues d’activité antibactérienne sont ensuite testées sur les deux souches de S. aureus résistantes par efflux, pour déceler une potentielle activité d’inhibiteur de pompe. Cette activité est alors confirmée par des expériences d’accumulation de l’antibiotique.

Au cours de cette étude, une nouvelle série de molécules présentant une bonne activité antibactérienne vis-à-vis des deux souches sensibles a été mise en évidence. Des résultats préliminaires indiquent que ces molécules inhibent la synthèse des protéines.

Le criblage réalisé vis-à-vis de la pompe d’efflux NorA a mis en évidence trois familles de molécules actives, dont on a vérifié qu’elles permettent de restaurer l’activité de plusieurs antibiotiques efflués par la pompe. Un criblage similaire réalisé sur la protéine Msr(A) a révélé quelques touches qui montrent une synergie avec l’antibiotique efflué ; leur activité sur l’accumulation de l’antibiotique doit être vérifiée. Par ailleurs, un modèle tridimensionnel de la protéine Msr(A) a été établi, par homologie avec les pompes cristallisées de la même famille (protéines à ATP-Binding Cassette). Ce modèle est en cours de validation..

Mots clés : criblage antibactérien, résistance aux antibiotiques, inhibiteur de pompe d’efflux, pompe NorA, pompe Msr(A), transporteur ABC, Staphylococcus aureus.