Lefebvre, Valérie (2005) Caractérisation des gènes AtNCED impliqués dans la biosynthèse de l'acide abscissique dans la graine d'Arabidopsis thaliana. PhD thesis Biologie cellulaire et moléculaire, INAPG.

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Abstract

The plant hormone abscisic acid (ABA) is involved in the response and adaptation to stress, as well as seed maturation and germination. ABA is produced from cleaved carotenoids (C40) and the early steps in its biosynthesis are common with those for the formation of pigments such as carotene and lycopene. Identification of the ABA deficient, viviparous mutant (vp14), enabled the cloning of a gene encoding a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase (NCED) (Schwartz et al., 1997) responsible for the cleavage of carotenoids to form xanthoxin (C15), considered to be the rate limiting reaction of the biosynthesis pathway. The subsequent analysis of these enzymes in other species found that they were encoded by multigene families, and that in Arabidopsis the family was composed of 9 members, termed AtNCED, only 5 of which appeared to be involved in ABA biosynthesis
(Iuchi et al., 2001) (Tan et al., 2003).
The work presented in this thesis concerns the characterisation of the AtNCED genes implicated in ABA biosynthesis in Arabidopsis seeds. An initial study of the 7 genes most homologous to VP14 was carried out with regard to their expression during seed development and in vegetative tissues. This found that 5 of the genes were expressed in seeds. Of these, AtNCED6 and AtNCED9 showed transcript accumulation that was specific to siliques. The detailed analysis of their expression patterns enabled AtNCED6 transcripts to be localised to the endosperm throughout seed development, with a peak in abundance at 14 DAF. The AtNCED9 gene was expressed slightly earlier that AtNCED6, and transcripts were detectable in both seed embryos and endosperm.
The phenotypes observed for Atnced9 and Atnced6 mutants were similar and weaker than those observed for
ABA deficient mutants affected in unique genes. ABA biosynthesis was apparently only affected in seeds, as observed by reduced ABA levels and paclobutrazol resistance; seed dormancy was, however, unaltered.
Dormancy and the requirement of gibberellins for germination would appear, therefore, to be differentially regulated by ABA. In contrast, seeds of the Atnced6, Atnced9 double mutant were less dormant. This implies that
ABA synthesized in the endosperm participates in the process of dormancy imposition during seed development.
Furthermore, seed fatty acid composition in the Atnced6 mutant was different from that of wild-type, which indicates that ABA synthesized in the endosperm is also involved in the regulation of seed reserves.
Analysis of the expression of two other genes, AtNCED2 and AtNCED3, found that although their temporal expression patterns were similar during seed development, the spatial expression patterns were different, suggesting that each enzyme could participate in the synthesis of ABA pools with distinct physiological roles.

Table of content

1. Introduction - 1
1.1. Avant propos - 1
1.2. Les graines: de la fécondation à la germination - 1
1.2.1. Généralités - 1
1.2.2. Arabidopsis thaliana, plante modèle - 2
1.2.3. Développement de la graine d'Arabidopsis - 2
1.2.3.1. Double fécondation - 2
1.2.3.2. Embryogenèse - 3
1.2.3.2.1. Polarité apico-basale - 3
1.2.3.2.2. Autres niveaux d'organisation - 4
1.2.3.2.3. Rôles de l'auxine dans la mise en place de l'embryon - 4
1.2.3.3. Développement de l'albumen - 5
1.2.3.3.1. Albumen syncytial - 6
1.2.3.3.2. Cellularisation de l'albumen - 6
1.2.3.3.3. Patron d'organisation - 6
1.2.3.4. Maturation de la graine d'Arabidopsis: accumulation des réserves - 7
1.2.3.4.1. Sucres - 7
1.2.3.4.2. Lipides - 7
1.2.3.4.3. Protéines - 8
1.2.3.5. Dessiccation de la graine d'Arabidopsis - 8
1.3. Régulation de la maturation de la graine d'Arabidopsis - 9
1.3.1. Facteurs de transcription et promoteurs cibles - 9
1.3.1.1. Mise en évidence d'éléments de signalisation - 9
1.3.1.2. Les ABRE - 9
1.3.1.3. Les RY - 10
1.3.1.4. Les facteurs de transcription - 10
1.3.2. Transition entre l'embryogenèse et la maturation - 10
1.3.3. Contrôle de l'accumulation des réserves - 11
1.3.4. Régulation de l'acquisition de la tolérance à la dessiccation - 12
1.4. Dormance primaire et germination - 14
1.4.1. Définitions et caractéristiques - 14
1.4.2. Rôles des téguments de la graine chez Arabidopsis - 14
1.4.3. Métabolisme de la graine en germination - 15
1.4.3.1. Réhydratation de la graine - 15
1.4.3.2. Mobilisation des réserves - 16
1.5. Dormance versus germination: une balance hormonale - 16
1.5.1. Théorie de la balance hormonale - 16
1.5.2. L'ABA induit la dormance et inhibe la germination - 17
1.5.3. Facteurs développementaux associés à la signalisation par l'ABA - 18
1.5.4. GAs, régulateurs positifs de la germination - 19
Sommaire
1.5.4.1. La germination nécessite la synthèse de GAs - 19
1.5.4.2. Modes d'actions des GAs - 19
1.5.4.3. Signalisation des GAs associée à la germination - 20
1.6. Dormance et germination: un cross-talk hormonal - 21
1.7. Biosynthèse de l'ABA - 22
1.7.1. La voie indirecte - 22
1.7.2. La voie du glyceraldéhyde phosphate/pyruvate - 23
1.7.3. De C5 à C40 - 23
1.7.4. ZEP - 24
1.7.4.1. Caractérisation biochimique - 24
1.7.4.2. Caractérisation moléculaire - 24
1.7.4.3. Expression - 25
1.7.4.3.1. Rythme ciracadien - 25
1.7.4.3.2. Stress hydrique - 25
1.7.4.3.3. Graines en développement - 26
1.7.4.3.4. Photoprotection et VDE: le cycle des xanthophylles - 27
1.7.5. Origine des composés en C15: les 9-cis-époxycaroténoïdes - 27
1.7.5.1. La xanthoxine, premier composé en C15 - 27
1.7.5.2. Conformation cis des précurseurs de la xanthoxine - 28
1.7.5.3. Néoxanthine synthase et isomérases - 28
1.7.6. 9-cis-epoxycaroténoïde dioxygénase (NCED) - 29
1.7.6.1. Caractérisation moléculaire et biochimique - 29
1.7.6.2. La Famille multigénique NCED d'Arabidopsis - 30
1.7.6.2.1. Activité - 30
1.7.6.2.2. Expression - 30
1.7.6.3. Le clivage des xanthophylles serait l'étape-clef régulatrice de la synthèse d'ABA - 31
1.7.6.4. Localisation sub-cellulaire - 32
1.7.7. Les étapes cytoplasmiques - 32
1.7.7.1. De la xanthoxine à l'ABA - 32
1.7.7.2. Conversion de la xanthoxine en AB-aldéhyde - 33
1.7.7.2.1. Caractérisation moléculaire et biochimique - 33
1.7.7.2.2. Expression chez Arabidopsis - 33
1.7.7.3. L'AB-aldéhyde oxydase - 34
1.7.7.3.1. L'AB-aldéhyde oxydase possède un cofacteur à molybdène - 34
1.7.7.3.2. AB-aldéhyde oxydase - 34
1.7.7.3.3. Expression tissulaire et subcellulaire - 35
1.7.8. Catabolisme de l'acide abscissique - 36
1.7.8.1. L'hydroxylation - 36
1.7.8.2. La conjugaison - 37
1.8. Présentation du projet de thèse - 37
2. Résultats - 39
Sommaire
2.1. La famille AtNCED dans les graines - 39
2.1.1. Caractérisation de la famille multigénique chez Arabidopsis - 39
2.1.2. Expression des gènes AtNCED et AtCCD - 39
2.1.2.1. Northern blot in planta - 39
2.1.2.2. Northern in silico - 41
2.2. Analyse fonctionnelle du gène AtNCED6 - 42
2.2.1. Résumé - 42
2.2.1.1. Résumé - 42
2.2.1.2. Summary - 43
2.2.2. Introduction - 44
2.2.3. Results - 45
2.2.3.1. AtNCED6 gene is involved in ABA biosynthesis in vivo - 45
2.2.3.2. Temporal regulation of AtNCED6 transcript in developing seeds - 47
2.2.3.3. AtNCED6 is specifically expressed in the endosperm - 47
2.2.3.4. Molecular characterization of Atnced6 mutants - 48
2.2.4. Atnced6 mutants exhibited ABA-deficient phenotypes in seeds, but not in vegetative tissues 48
2.2.4.1. ABA synthesis in the endosperm regulates lipid accumulation in seeds - 49
2.2.5. Discussion - 50
2.2.6. Material and methods - 52
2.2.6.1. Plant material and growth conditions - 52
2.2.6.2. Germination experiments - 53
2.2.6.3. Water loss assays - 53
2.2.6.4. ABA content - 53
2.2.6.5. NCED6 probe specificity - 53
2.2.6.6. Northern blot analysis - 54
2.2.6.7. In situ hybridization - 54
2.2.6.8. Cloning and plant transformation - 55
2.2.6.9. Reporter gene analysis - 55
2.2.6.10. Lipid composition analysis - 56
2.3. AtNCED9, un gène de biosynthèse de l'ABA exprimé dans la graine - 57
2.3.1. Analyse de l'expression de AtNCED9 dans les graines en développement - 57
2.3.1.1. Expression temporelle de AtNCED9 par northern blot - 57
2.3.1.2. Utilisation des gènes rapporteurs - 57
2.3.1.3. Hybridation in situ - 57
2.3.2. Implication de AtNCED9 dans la biosynthèse de l'ABA - 58
2.3.2.1. Recherche de mutants - 58
2.3.2.2. Caractérisation des insertions - 58
2.3.2.3. Caractérisation physiologique des mutants Atnced9 - 60
2.3.2.3.1. Physiologie des parties végétatives - 60
2.3.2.3.2. Physiologie des graines - 61
2.3.2.3.3. Isolement des doubles mutants Atnced6, Atnced9 - 63
Sommaire
2.3.2.3.4. Analyse physiologique de Atnced6, Atnced9 - 63
2.3.3. Expression tissulaire des gènes AtNCED2 et AtNCED3 - 64
2.3.3.1. Utilisation du gène rapporteur GUS - 64
2.3.3.2. Localisation de l'expression de AtNCED2 - 64
2.3.3.3. Localisation de l'expression de AtNCED3 - 65
2.3.4. Discussion - 66
2.4. Matériels et méthodes complémentaires - 68
2.4.1. Matériels - 68
2.4.1.1. Matériel végétal (Arabidopsis thaliana) - 68
2.4.1.2. Souches bactériennes - 68
2.4.1.3. Vecteurs - 69
2.4.2. Méthodes - 69
2.4.2.1. Culture des bactéries - 69
2.4.2.2. Manipulation du matériel végétal - 70
2.4.2.2.1. Stérilisation des graines - 70
2.4.2.2.2. Conditions de culture - 70
2.4.2.2.3. Transformation des plantes par A. tumefaciens - 70
2.4.2.3. Tests physiologiques - 71
2.4.2.3.1. Cinétiques de germination - 71
2.4.2.3.2. Test de résistance au paclobutrazol - 71
2.4.2.3.3. Test de déshydratation - 71
2.4.2.3.4. Mesure de la teneur en ABA - 71
2.4.2.4. Analyses moléculaires - 72
2.4.2.4.1. Extraction, amplification et clonage de l'ADN - 72
2.4.2.4.2. Clonage des promoteurs des gènes AtNCED2, AtNCED3 et AtNCED9 en amont des gènes rapporteurs GUS et GFP - 76
2.4.2.5. Analyse de l'expression des gènes - 77
2.4.2.5.1. Extraction d'ARN de feuilles - 77
2.4.2.5.2. Extraction d'ARN de graines - 77
2.4.2.5.3. Extraction des ARNs pour l'analyse en RT-PCR - 78
2.4.2.5.4. Electrophorèse d'ARN - 78
2.4.2.5.5. Transfert d'ARN sur membrane de nylon: northern blot - 79
2.4.2.5.6. Hybridation des membranes de northern blot - 79
2.4.2.5.7. Hybridation in situ - 79
2.4.2.5.8. Test histochimique de l'activité b-glucuronidase (GUS) - 82
3. Discussion générale et perspectives - 83
3.1. Expression des gènes AtNCED - 83
3.2. Redondance fonctionnelle des gènes AtNCED - 85
3.3. L'expression d'AtNCED9 est localisée dans l'embryon - 86
Sommaire
3.4. Régulation de la synthèse des réserves lipidiques - 86
3.5. L'ABA synthétisé dans l'albumen participe à la mise en place de la dormance - 87
3.6. Dormance et résistance au paclobutrazol, deux phénotypes dissociables - 88
3.7. Régulation hormonale de la germination - 89
3.8. Conclusion et perspectives - 90
4. Références bibliographiques - 91
5. Annexes - 101

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