Colonna, Anne (2005) Ultrafast polarization and vibrational motions in bacteriorhodopsin studied by coherent infrared emission spectroscopy. PhD thesis LOB, EP - LOB Laboratoire d'Optique et Biosciences, EP/X p.178.

Alternative Locations: http://www.imprimerie.polytechnique.fr/Theses/Files/Colonna.pdf

Abstract

This work aims at elucidating primary proteins dynamics. More specifically, it deals with retinal proteins, which are in particular involved in vision processes. The model protein used is bacteriorhodopsin, a bacterial membrane protein that converts solar energy into a protons gradient. Upon absorption of a photon by the retinal cofactor, two phenomena appear, whose respective role and chronological order are still unknown: retinal isomerization in few hundreds femtoseconds and an ultrafast polarization of the retinal/protein system.
The used spectroscopic method enables us to detect and quantify charge displacements with 13 fs time resolution, thus allowing temporal separation of both phenomena. It is based on
a second order nonlinear process, optical rectification: following excitation with an oscillating electric field, an ultrafast directional polarization is created in a non centrosymetric medium.
This medium consists of multilayer of oriented dry purple membranes, containing bacteriorhodopsin.
The infrared beam emitted upon generation of the polarization is detected by letting it interfere with a broadband infrared reference beam created by optical rectification in a nonlinear crystal (GaAs or AgGaS2).
The infrared beam emitted by bacteriorhodopsin directly reflects the dipole moment change between ground and excited states. In addition to this instantaneous response, a long lasting (up to several picoseconds) infrared emission is detected, reflecting charge displacements associated with vibrational motions of the retinal/protein complex. The separation of the two types of responses, and the detailed description of the overall signal in terms of frequency and phase, requires concerted use of several analysis methods.
In this way, we have shown that an ultrafast (<13 fs) photoinduced transmembrane charges displacement takes place in bacteriorhodpsin. The associated dipole moment change
(30 D) is higher in the protein complex, up to a factor 1.5 compared to retinal in solution. The simultaneous detection of both the electronic and vibrational responses paves the way to study the functional role of the initial polarization for the subsequent structural dynamics.

Table of content

Introduction - 1
1 Les protéines à rétinal - 3
1.1 Les protéines impliquées dans le transport transmembranaire - 3
1.2 La famille des rhodopsines - 5
1.2.1 Les photorécepteurs visuels - 5
1.2.2 Les protéines de la bactérie Halobacterium salinarium - 7
1.3 La bactériorhodopsine - 9
1.3.1 Structure - 9
1.3.2 Le photocycle - 9
1.3.3 Les photoproduits - 11
1.3.4 Pourquoi étudier la bactériorhodopsine ? - 13
1.4 Controverse: quel est le premier processus photoinduit ? - 14
2 Spectroscopie cohérente d’émission infrarouge - 21
2.1 Etude de mouvements de charges - 21
2.1.1 Etude de la séparation de charges - 22
2.1.1.1 Non linéarité du deuxième ordre et déplacement de charges - 22
2.1.1.2 Couplage électron-vibration - 23
2.2 Interaction laser-matière - 25
2.2.1 Représentation classique du champ excitateur et passage en notations complexes - 25
2.2.2 Modèle de l’oscillateur anharmonique à une dimension - 26
2.2.3 Calcul de la polarisation induite - 29
2.3 Source infrarouge femtoseconde par redressement optique - 32
2.3.1 Impulsion électromagnétique générée par variation rapide de la polarisation - 32
2.3.2 Caractéristiques du champ rayonné associé à la polarisation induite - 33
2.3.2.1 Milieu plan infiniment mince - 35
2.3.2.2 Propagation dans un milieu épais - 38
2.3.3 Matériaux utilisés pour la génération d’infrarouge - 44
2.4 Détection interférométrique de l’émission infrarouge - 45
2.4.1 Méthode de déection du champ émis - 45
2.4.1.1 Détection électro-optique - 45
2.4.1.2 Interférométrie infrarouge/infrarouge - 45
2.4.2 Montage expérimental - 47
2.4.2.1 Oscillateur Titane-Saphir - 48
2.4.2.2 L’amplificateur - 51
2.4.2.3 L’oscillateur paramétrique optique non colinéaire (NOPA) - 51
2.4.2.4 Spectromètre infrarouge - 55
2.5 Génération d’infrarouge dans des cristaux non linéaires - 59
2.5.1 Source infrarouge à base de GaAs - 59
2.5.2 Source infrarouge à base d’AgGaS2 - 60
2.5.2.1 Caractéristiques du champ infrarouge émis - 60
2.5.2.2 Mesure de la durée des impulsions visibles - 62
2.5.3 Résolution du système - 63
2.5.3.1 Limite par le générateur infrarouge - 63
2.5.3.2 Limite par l’interféromètre - 64
3 Préparation et comparaison des échantillons - 65
3.1 Obtention de bactériorhodopsine - 67
3.1.1 Culture de la bactérie Halobacterium salinarium et isolement des membranes pourpres - 67
3.1.2 Spectres d’absorption caractéristiques - 68
3.2 Préparation des échantillons - 69
3.2.1 Echantillons orientés - 69
3.2.1.1 Déposition par électrophorèse - 69
3.2.1.2 Modification du photocycle avec l’humidité - 71
3.2.2 Echantillons à pH acide - 72
3.2.2.1 Principe de l’acidification - 72
3.2.2.2 Influence de l’environnement du rétinal sur les spectres d’absorption et le photocycle - 73
3.3 Comparaison des premiers photoproduits - 75
3.3.1 Expérience pompe-sonde - 75
3.3.1.1 Principe - 75
3.3.1.2 Description du montage expérimental - 76
3.3.1.3 Acquisition du signal - 77
3.3.1.4 Ajustement des données cinétiques - 77
3.3.2 Résultats sur l’échantillon liquide, adapté à la lumière, entraîné en mouvement
- 78
3.3.2.1 Evolution de l’absorption transitoire - 78
3.3.2.2 Données cinétiques - 79
3.3.3 Résultats sur l’échantillon sec - 80
3.3.4 Contribution de la forme 13-cis du rétinal - 82
3.3.4.1 Variation des spectres d’absorption transitoire avec l’intensité excitatrice - 82
3.3.4.2 Variation des données cinétiques avec l’intensité excitatrice - 84
3.3.4.3 Pourcentage de forme 13-cis du rétinal à l’arrivée du faisceau pompe - 85
3.3.4.4 Obtention du spectre d’absorption transitoire de la forme 13-cis du rétinal - 87
3.3.5 Modification du pH - 88
3.3.5.1 Etude des échantillons déposés dans des gels - 88
3.3.5.2 Effet d’une diminution du pH - 89
3.3.6 Etude de l’influence de l’humidité sur le rendement quantique de la photoisom érisation - 92
3.3.6.1 Méthode de calcul - 92
3.3.6.2 Résultats - 93
3.3.7 Conclusions - 94
4 Emission infrarouge et transfert de charges dans la bactériorhodopsine - 95
4.1 Allure des signaux émis par la bactériorhodopsine - 96
4.2 Réponse électronique: redressement optique dans la bactériorhodopsine - 98
4.2.1 Caractérisation de l’émission - 98
4.2.1.1 Vérification de la non linéarité du second ordre du signal - 98
4.2.2 Modèle du redressement optique dans la bactériorhodopsine: théorie et simulations - 105
4.2.2.1 Approche semi-classique des interactions laser/matière - 105
4.2.2.2 Calcul de la polarisation induite - 109
4.2.2.3 Simulation de la polarisation pour différents paramètres - 113
4.2.3 Mesure du changement dipolaire suite à une excitation lumineuse - 118
4.2.4 Conséquence sur les premiers processus photoinduits dans bR ? - 121
4.3 Etude de la réponse vibrationnelle - 123
4.3.1 Théorie - 123
4.3.1.1 Oscillation de paquets d’ondes vibrationnels - 123
4.3.1.2 Analogie avec un phénomène de différence de fréquences - 124
4.3.2 Analyse des données expérimentales - 125
4.3.2.1 Spectre de la partie vibrationnelle - 126
4.3.2.2 Spectrogramme - 128
4.3.2.3 Modèle d’analyse cinétique - 133
4.3.2.4 Résultats des ajustements - 135
Conclusion et perspectives - 143
A Annexe A, Notations et conventions utilisées - 147
A.1 Transformée de Fourier - 147
A.1.1 Définitions - 147
A.1.2 Analyse par transformée de Fourier à fenêtre glissante - 148
A.2 Grandeurs physiques - 150
A.3 Abréviations biologiques - 151
B Annexe B, Modèle d’une antenne dipolaire - 153
C Annexe C, Protocoles - 157
C.1 Culture des bactéries Halobacterium salinarium et purification des membranes
Pourpres - 157
C.2 Echantillons déposés dans des gels d’acrylamide - 158
D Annexe D, Applications biotechnologiques de la bactériorhodopsine - 159
D.1 Protection de papiers officiels - 159
D.2 Stockage de données: mémoire holographique - 159
D.3 Papier et encre ´electronique - 160
D.4 Photodétection et vision artificielle - 160
Bibliographie - 170

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