Le Saux, Thomas (2004) Détermination des paramètres d'interaction non-covalente en solution par les méthodes électrophorétiques capillaires. Champ d'application et performances. Rationalisation des protocoles. PhD thesis Chimie Analytique, ENSCP.

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Abstract

Les interactions non-covalentes en solution jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus chimiques, biologiques, pharmacologiques. Il est donc d'intérêt de pouvoir quantifier ces interactions. Parmi les méthodes de quantification disponibles, l'électrophorèse capillaire semble particulièrement bien adaptée (miniaturisation, absence de phase stationnaire). Au cours de ces travaux, plusieurs systèmes modèles ont été caractérisés au moyen de trois méthodes électrophorétiques (injection directe, électrophorèse d'affinité et analyse frontale): la distribution d'un soluté dans une phase liposomale, l'interaction entre un polysaccharide (héparine) et une protéine (antithrombine III), les seuils d'agrégation de tensioactifs, l'inclusion de petites molécules dans la beta-cyclodextrine. Pour chacun de ces modèles, une attention particulière a été portée aux spécificités des méthodes électrophorétiques utilisées et à l'intérêt de certaines modélisations.

Table of content

Introduction générale - 1
Chapitre 1. Bibliographie - 4
CHAPITRE 1. BIBLIOGRAPHIE - 5
1. EQUILIBRES CHIMIQUES ET ISOTHERME D'ADSORPTION - 5
1.1 EQUILIBRES MULTIPLES SUCCESSIFS [1] - 5
1.2 MODELES DE SITES. [2] - 6
1.2.1 Cas général de l'adsorption de ligands sur un substrat - 6
1.2.2 Modèle des sites indépendants et d'énergies identiques [2] - 8
1.2.3 Extensions du modèle de sites indépendants - 16
1.2.3.1 Equilibre chimique de type 1 :1 - 16
1.2.3.2 Nombre de classes de sites indépendants supérieur à 1 - 17
1.2.3.3 Notion de coopération - 19
1.2.3.4 Modèle de compétition - 23
2 METHODES ELECTROPHORETIQUES DE DETERMINATION DES CONSTANTES D'INTERACTION - 23
2.1 METHODE DE L'INJECTION DIRECTE - 24
2.2 METHODES BASEES SUR LA VARIATION DE LA MOBILITE ELECTROPHORETIQUE - 29
2.2.1 Electrophorèse capillaire d'affinité (ECA) - 29
2.2.1.1 Cas d'une interaction monomoléculaire - 29
2.2.1.2 Cas de complexations d'ordres supérieurs - 32
2.2.1.3 Cas de deux ligands compétitifs pour un même substrat - 33
2.2.1.4 Cas des cinétiques lentes - 35
2.2.1.5 Méthodes de remplissage partiel du capillaire - 36
2.2.2 Electrophorèse d'affinité et de vacance - 39
2.3 METHODES BASEES SUR LA QUANTIFICATION D'AIRES DE PICS DE VACANCE - 42
2.3.1 Méthode des pics de vacance - 42
2.3.2 Méthode d'Hümmel et Dreyer - 44
2.4 METHODES BASEES SUR L'ANALYSE FRONTALE - 46
2.4.1 Analyse frontale électrocinétique continue - 46
2.4.2 Analyse frontale avec injection en mode hydrodynamique - 48
2.4.3 Protocoles particuliers de l'analyse frontale - 49
2.4.3.1 Injection électrocinétique sélective - 49
2.4.3.2 Ajout de polymère réticulé - 50
2.5 EXEMPLES D'APPLICATIONS - 51
2.6 CONCLUSION - 53
3 REFERENCE BIBLIOGRAPHIQUES - 54
Chapitre 2. Caractérisation d'une distribution liposomale par électrophorèse capillaire - 59
1 INTRODUCTION - 59
2 LIPOSOMES - 60
2.1 DEFINITION, STRUCTURE ET CLASSIFICATION - 60
2.2 UTILISATION DES LIPOSOMES - 61
2.3 LIPOSOMES ET ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - 63
2.3.1 Situation actuelle - 63
2.3.2 Détermination de la concentration en forme libre d'un soluté en équilibre avec une phase liposomale - 67
2.3.2.1 Méthodes électrophorétiques applicables à la détermination directe ou indirecte de concentrations de formes libres en équilibre avec une forme associée - 67
2.3.2.2 Modèles réactionnels - 69
3 CARACTERISATION DES LIPOSOMES PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - 71
4 DETERMINATION PAR ELECTROPHORESE CAPILLAIRE DE LA CONCENTRATION LIBRE D'UN SOLUTE EN PRESENCE D'UNE PHASE LIPOSOSOMALE - 76
4.1 CHOIX D'UNE METHODE ELECTROPHORETIQUE - 76
4.2 ANALYSE FRONTALE COUPLEE A UNE INJECTION ELECTROCINETIQUE CONTINUE - 77
4.3 PROTOCOLE INTEGRE D'INJECTION DIRECTE SELECTIVE EN MODE ELECTROCINETIQUE COUPLEE A UNE PRECONCENTRATION EN LIGNE - 80
4.3.1 Application au méthylparabène - 87
4.3.2 Application à l'éthylparabène - 88
4.3.3 Application au propylparabène - 92
4.3.4 Relation log P-K' - 95
4.3.5 Application à la détermination de la concentration d'un principe actif libre dans une formulation liposomale - 95
5 CONCLUSION - 100
6 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 101
7 ANNEXES - 103
ANNEXE 1: ECHANTILLONS - 103
ANNEXE 2: INSTRUMENTATION - 104
ANNEXE 3: TAMPONS ET MARQUEURS - 105
Chapitre 3. Modélisation des profils électrophorétiques: une nouvelle approche de l'électrophorèse capillaire d'affinité - 107
1 INTRODUCTION - 107
2 MODELISATION DES PROFILS ELECTROPHORETIQUES - 109
2.1 MODELE DE MIKKERS [3] - 109
2.2 MODELE DE ERNY ET COLL - 115
2.3 DISCUSSION - 117
3 RESULTATS ET DISCUSSION - 119
3.1 SYSTEMES BETA-CYCLODEXTRINE-NAPROXENE ET BETA-CYCLODEXTRINE-NAPHTALENE-2-SULFONATE - 119
3.1. a Etude de la dispersion par électromigration en l'absence de ligand - 121
3.1. b Etude de la dispersion par électromigration en présence de ligand - 125
3.1. c Estimation de la concentration en ligand libre dans la zone de substrat - 130
3.2 SYSTEME BETA-CYCLODEXTRINE-ADAMANTANE-1-CARBOXYLATE - 135
3.2. a Etude de la dispersion par électromigration en l'absence de ligand - 136
3.2. b Etude de la dispersion par électromigration en présence du ligand - 138
3.2. c Influence du temps de formation du complexe à l'équilibre sur les mobilités observées de l'adamantane-1-carboxylate - 141
4 CONCLUSION - 142
5 ANNEXES - 143
ANNEXE A1: CALCUL DE CORRECTION DE FORCE IONIQUE SUR LA VALEUR DE PKA DU TAMPON CARBONATE DE SODIUM [20] - 143
ANNEXE A2: MODELISATION DU TEMPS DE MIGRATION EN ELECTROPHORESE CAPILLAIRE D'AFFINITE - 144
ANNEXE A3: SOLUTIONS TAMPONS ET ANALYTES - 147
6 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 148
Chapitre 4. Développement de l'analyse frontale pour la caractérisation de l'interaction entre un polysaccharide sulfaté (l'héparine) et une proteine cible (l'antithrombine III) - 151
1 INTRODUCTION - 151
2 COAGULATION ET THROMBOSE [1-3] - 152
2.1 CASCADE DE LA COAGULATION - 152
2.2 INHIBITION DE LA COAGULATION - 154
2.3 THROMBOSE - 154
2.4 FIBRINOLYSE - 154
3 HEPARINE - 155
3.1 STRUCTURE DE L'HEPARINE - 155
3.2 DIFFERENTS TYPES D'HEPARINE - 157
3.3 MECANISME D'ACTION DE L'HEPARINE - 158
3.4 AUTRES ACTIVITES BIOLOGIQUES DE L'HEPARINE [7, 13] - 159
3.5 HEPARINE ET ELECTROPHORESE CAPILLAIRE - 159
4 ETUDE DES CONSTITUANTS DU SYSTEME PAR ELECTROPHORESE DE ZONE - 160
4.1 ANTITHROMBINE SEULE - 160
4.2 HEPARINE SEULE - 162
4.3 MELANGE HEPARINE-ANTITHROMBINE-III - 165
4.4 CONCLUSION SUR L'ETUDE PAR INJECTION DIRECTE EN ELECTROPHORESE DE ZONE - 167
5 MISE AU POINT DE L'ANALYSE FRONTALE - 168
5.1 INJECTIONS HYDRODYNAMIQUES - 168
5.2 INJECTION ELECTROCINETIQUE - 171
5.2.1 Vérification de la linéarité de la hauteur des paliers de concentration de l'ATIII - 172
5.2.2 Application à la modélisation de l'interaction entre l'ATIII et l'héparine - 174
5.2.3 Méthode rapide de détermination d'une constante - 179
5.2.4 Conclusion sur la mise au point de la méthode d'analyse frontale - 181
6 APPLICATIONS DU PROTOCOLE D'ANALYSE FRONTALE DEVELOPPE - 182
6.1 CARACTERISATION PAR ELECTROCHROMATOGRAPHIE MICELLAIRE DE L'ANTITHROMBINE III - 182
6.2 ETUDE DE L'INFLUENCE DU PH ET LA FORCE IONIQUE DU MILIEU - 183
6.3 DETERMINATION DES PARAMETRES D'INTERACTION (CONSTANTE ET NOMBRE DE SITES) ENTRE LES OLIGOSACCHARIDES HEPARINIQUES AFFINS ET L'ATIII - 185
6.3.1 Exploitation des mesures: Adsorption de l'antithrombine III sur les dérivés hépariniques - 189
6.3.2 Exploitation des mesures: adsorption des dérivés hépariniques sur l'antithrombine III - 193
7 DISCUSSION SUR L'ANALYSE FRONTALE - 195
8 DETERMINATION DE LA CONSTANTE D'INTERACTION ENTRE DES PEPTIDES CONSENSUS DE L'ANTITHROMBINE III ET LES DERIVES HEPARINIQUES AFFINS - 197
9 CONCLUSION - 203
10 ANNEXES - 205
ANNEXE 1: SPECTRE DE L'ANTITHROMBINE III - 205
ANNEXE 2: REPRESENTATION DES ISOTHERMES ET DIAGRAMMES DE LINEARISATION DES DONNEES EXPERIMENTALES POUR LA DETERMINATION DES CONSTANTES D'ASSOCIATION - 206
ANNEXE 3: PREPARATION DES ELECTROLYTES ET MARQUEURS - 219
ANNEXE 4: SEQUENCE DE L'ANTITHROMBINE III HUMAINE [35] - 222
11 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 223
Chapitre 5. Détermination de seuils d'agrégation pour les tensioactifs absorbants ou transparents en uv, neutres ou chargés - 227
1 INTRODUCTION - 227
2 REACTIFS ET PRODUITS - 233
3 CAS DE TENSIOACTIFS ABSORBANT EN UV - 233
3.1 CARACTERISATION DES ECHANTILLONS COMMERCIAUX DE TENSIOACTIF PAR ELECTROPHORESE DE ZONE - 233
3.2 DETERMINATION DE LA CMC DE L'OCTYLBENZENESULFONATE ET DU DODECYLBENZENESULFONATE PAR LES METHODES CLASSIQUES - 235
3.2.1 Conductométrie - 235
3.2.2 Mesure de tension superficielle - 237
3.3 ANALYSE FRONTALE - 238
3.3.1 Octylbenzènesulfonate - 238
3.3.2 Dodécylbenzènesulfonate - 244
3.3.3 Protocole rapide de détermination de CMC d'un tensioactif pur - 247
4 CAS DE TENSIOACTIFS TRANSPARENTS EN UV - 247
4.1 EQUILIBRES ENTRE UN MARQUEUR NEUTRE ET UNE SOLUTION DE TENSIOACTIF - 247
4.2 CAS D'UN TENSIOACTIF ANIONIQUE: LE SDS - 250
4.3 CAS D'UN TENSIOACTIF CATIONIQUE: LE BROMURE DE TETRADECYLTRIMETHYL-AMMONIUM - 253
4.4 CAS D'UN TENSIOACTIF NEUTRE: LE BRIJ 35 - 257
5 CONCLUSION - 260
6 RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES - 262
7 ANNEXE: PREPARATION DES ELECTROLYTES SUPPORTS - 264
Conclusion générale et perspectives - 265

Statistiques de consultation

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